摘要:

摘要:为研究大黄鱼肿瘤抑制因子cylindromatosis (CYLD)在免疫反应中的作用，本实验克隆了大黄鱼CYLD的全长cDNA (命名为LcCYLD)并对其进行序列分析；采用实时荧光定量PCR (qPCR)的方法对大黄鱼各组织及免疫刺激后的大黄鱼肾细胞系中的LcCYLD表达变化进行检测；构建了重组表达载体pTurboGFP-CYLD及pcDNA3.1-CYLD，分别用于亚细胞定位实验及过表达实验；在HEK293T细胞系中过表达LcCYLD后采用双荧光素酶报告系统检测了NF-κB、TNF-α及IL-1β启动子活性的变化。结果显示，LcCYLD的ORF包含2 754 bp，编码917个氨基酸，推测具有保守的3个N端的CAP-GLY结构域，1个磷酸化区域和1个C端的UCH结构域，多序列比对结果显示各物种CYLD间高度保守；系统进化分析显示，LcCYLD与来源于其他硬骨鱼的CYLD聚为一支，其中与条纹狼鲈的CYLD关系最近；转录水平表达分析发现，LcCYLD在大黄鱼各组织均有表达，其中在脑中表达量最高；LPS及poly I:C刺激能够显著诱导LcCYLD的表达；亚细胞定位实验表明LcCYLD在细胞质及细胞核中均有表达；过表达LcCYLD能够显著抑制NF-κB及促炎细胞因子TNF-α及IL-1β的转录激活。以上研究结果表明，大黄鱼CYLD能够抑制NF-κB的转录激活，为深入了解LcCYLD在大黄鱼先天免疫信号转导中的作用奠定基础。

摘要:丝氨酸蛋白酶 (SP)是一类分布广泛的蛋白水解酶，行使着一系列重要的生理功能，包括参与消化作用、血液凝结、胚胎发育和免疫应答过程等，但在甲壳动物中仅见初步报道。对虾的养殖持续面临着病害的困扰，深入开展对虾免疫防御机制研究，将会为寻找抗病新思路提供借鉴。本研究利用RACE技术克隆获得了一个新的凡纳滨对虾丝氨酸蛋白酶同源物 (serine protease homologs, SPHs)基因 (Lv-SPH)的全长cDNA序列，通过生物信息学方法分析了其序列特点，并利用实时荧光定量PCR (qPCR)方法探讨了其组织分布特征和应答病毒感染的表达变化模式。生物信息学分析显示该基因全长1 249 bp，开放阅读框 (ORF)区长1 005 bp，5′-UTR为156 bp，3′-UTR为88 bp，ORF区编码334个氨基酸，氨基端的16个氨基酸为预测的信号肽序列。经在线分析软件SMART分析显示，Lv-SPH含有一个clip结构域和一个高度保守的SP结构域 (Tryp-SPc)，后者具有3分子活性催化位点，前2个是组氨酸和天冬氨酸，第3位为甘氨酸。该基因在凡纳滨对虾各种组织中有不同程度的表达，其中在血细胞中表达量最高，在肝胰腺、心脏和肠道中广泛表达，而在肌肉中表达量最低。注射白斑综合征病毒 (WSSV)后24 h，Lv-SPH的相对表达量显著升高，病毒感染后48 h达到最高，约为对照组的3倍。Lv-SPH具备典型的SPH家族成员特征，具有一定的组织表达特异性，WSSV可以显著诱导该基因表达上调，表明其可能参与了WSSV引发的凡纳滨对虾免疫应答过程。研究结果为深入探讨对虾天然免疫调控机制提供了参考，在对虾健康养殖及病害防治方面具有潜在的应用价值。

摘要:虾虹彩病毒病是一种感染甲壳类的急性、传染性疾病，其病原为虹彩病毒科的一个新属即十足目虹彩病毒属的十足目虹彩病毒1 (Decapod iridescent virus 1，DIV1)。DIV1传播速率快、宿主范围广、致死率高，近年来在对虾养殖过程中广泛流行，给我国对虾养殖业造成巨大经济损失。目前，对DIV1引发的虾虹彩病毒病的病原学、病理学、流行病学、检测诊断等方面已开展了部分研究，但对病毒感染的分子机制、宿主的应答规律等还知之甚少。本文对DIV1的发现过程、分类地位、形态特征、感染特性、机体响应机制、基因组信息、宿主范围、传播途径及检测方法等方面的最新研究进展进行了综述，阐述了疾病防控及未来展望，以期为虾虹彩病毒病的深入研究及有效防控提供参考。

摘要:为探明2021年3月福建某水库养殖大口黑鲈疾病暴发的原因，实验从患病大口黑鲈肝脏、肾脏、脾脏中分离优势菌，通过人工感染实验确定病原菌，并综合16S rDNA基因序列分析、生理生化和质谱特征等技术对该病原菌进行种属鉴定，同时，进行毒力基因检测、药物敏感性实验以及组织病理学观察。结果显示，从病鱼脾脏中分离获得1株优势菌并鉴定为鲁氏耶尔森氏菌；该菌株对大口黑鲈的半致死剂量为3.8×10⁵ CFU/尾；该菌株携带yrP1、yhlA、yhlB等毒力基因，对恩诺沙星、盐酸多西环素、氟甲喹、硫酸新霉素、氟苯尼考等5种药物相对敏感。组织病理学观察发现，鲁氏耶尔森氏菌的感染造成大口黑鲈肝脏、肾脏、脾脏不同程度的损伤，表现为明显的变性、坏死及炎症细胞的浸润等。本研究首次报道了鲁氏耶尔森氏菌对养殖大口黑鲈的致病性，可为养殖大口黑鲈鲁氏耶尔森氏菌病的诊断和药物防治提供参考依据。

摘要:为了探究鼠李糖凝集素 (RBL)在硬骨鱼非特异性细胞防御病原菌感染中的作用，实验以尼罗罗非鱼为研究模型，首先通过分离头肾单核/巨噬细胞进行体外菌应激实验，结果发现，尼罗罗非鱼在2种致病菌即无乳链球菌和嗜水气单胞菌应激后，尼罗罗非鱼L-鼠李糖凝集素1基因 (Onrbl-1)的表达量显著上调。然后，通过荧光定量PCR (qRT-PCR)检测发现，OnRBL-1重组蛋白能够调节病原菌诱导细胞炎症因子的表达，包括显著抑制细菌诱导的il-6、il-8和tnf-α的表达，促进il-10和tgf-β的表达。此外，通过流式细胞术检测证实OnRBL-1重组蛋白具有促进单核/巨噬细胞的吞噬作用，同时增强呼吸爆发水平和上调活性氧的释放。以上研究表明，OnRBL-1在尼罗罗非鱼单核/巨噬细胞炎症因子表达、吞噬作用、呼吸爆发和活性氧释放等非特异性细胞免疫防御中发挥调节作用。本研究为探讨RBL-1在硬骨鱼宿主防御病原菌感染中的功能提供了参考，并有助于完善和丰富硬骨鱼类RBL的功能和在抗菌免疫应答中的基础理论体系，具有重要的科学意义。

摘要:为研究乌鳢诺卡氏菌的致病机理，本实验通过病原分离鉴定、组织病理学和基因表达水平分析对病原菌的致病性、药物敏感性及乌鳢的免疫抗性进行了研究。结果显示，患病乌鳢主要感染了命名为SDAT 0011病原菌，通过菌落形态观察、革兰氏染色鉴定、生理生化鉴定、16S rRNA鉴定及诺卡氏菌特异序列扩增鉴定，结果均显示该病原菌为鰤诺卡氏菌。将分离的SDAT 0011感染健康乌鳢后，1 × 10⁵~1 × 10⁸ CFU/mL注射组的死亡率均为100%，感染乌鳢出现明显的诺卡氏菌病症状，如内脏出血，肝脏、脾脏和肾脏中有大量大小不等的结节，组织病理切片进一步检测发现，结节分界清晰，结节中有大量的淋巴细胞、受损或死亡的组织细胞。药物敏感性实验发现，鰤诺卡氏菌对利福平等抗生素较为敏感，对青霉素等具有较强的抗性。基因表达分析显示，在感染初期 (48 h)及中后期，Toll样受体2基因 (TLR2)和Toll样受体13基因 (TLR13)在脾脏和头肾的表达水平显著上调，而趋化因子受体9基因 (CCR9)在脾脏和头肾中显著下调，这表明乌鳢Toll样受体和趋化因子受体信号通路可能在其抵抗鰤诺卡氏菌感染中起重要作用。本实验为乌鳢诺卡氏菌病的治疗及其致病机理研究提供了重要的基础。

摘要:为准确鉴定鳜肤孢虫病的病原，实验基于形态学比较，结合寄生特征分析和分子系统学方法开展研究，并观察超微结构。形态学观察结果显示，纺锤形或哑铃形白色孢囊，长约1.9~6.8 mm，寄生于鳍条、皮肤、口腔、鳃盖内外表面和鳃丝；圆形内生孢子，直径约 (9.8±1.8) (7.3~13.8) μm；孢子内环状细胞质和直径约 (6.5±1.2) (3.9~8.3) μm的圆形折光体，鉴定其为肤孢虫。该物种测量值区别于其他肤孢虫，与寄生于鳜鳃的未定种 (HB)测量值基本一致；与广东省和河南省的鳜源鳗鲡肤孢虫 (GD和HN)以及HB寄生于相似部位。分子序列比对和系统发育结果显示，该物种与GD、HN、芬兰肤孢虫、鲑肤孢虫和寄生美洲鳗鲡的鳗鲡肤孢虫序列的一致性大于99%；与GD和HN的亲缘关系最近，与鲑肤孢虫次之，与芬兰肤孢虫和鳗鲡肤孢虫的亲缘关系较远。综上，该物种与已报道的寄生与鳜的肤孢虫为同种，并修订寄生鳜的鳗鲡肤孢虫的GD和HN分离株记录；将本研究肤孢虫和HB、GD和HN分离株一同命名为鳜肤孢虫 (Dermocystidium sinipercae sp. n.)，新种。鳜肤孢虫种内形态差异可能与采样时间和发育阶段有关；孢子增殖分化过程在超微结构观察中被记录和描述。本研究证实鳜肤孢虫已于我国多地分布，强调鳜产地检疫措施亟待落实。

摘要:为了验证维生素C碳点对水生动物病原菌的抑制效率，实验采用3倍梯度稀释法检测了维生素C碳点对嗜水气单胞菌、副溶血性弧菌、灿烂弧菌、诺卡氏菌等12种常见水产病原菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)，在此基础上，测定了其对这12种水产病原菌的抑菌动力学曲线。此外，基于纳米材料可能存在的生物相容性等问题，实验采用MTT法检测了维生素C碳点对草鱼肾细胞的细胞毒性，并以斑马鱼胚胎为测试对象，测定其经维生素C碳点暴露后的胚胎毒性。结果显示，维生素C碳点对所监测的12种水产病原菌均有显著的抑制作用，MIC为20.6~61.7 μg/mL，基本达到与抗生素氟苯尼考同等的抗菌作用。维生素C碳点在MIC范围内胚胎和细胞存活率可接近100%，与对照组无差异。研究表明，维生素C碳点对水产主要病原菌有良好的杀菌和抗菌效果，具有较好的生物相容性，在水产养殖细菌性病害防治上具有潜在的开发应用前景。

摘要:为进一步研究CD8α、CD207在草鱼树突状细胞 (dendritic cells，DCs)中的功能，实验构建了草鱼CD8α、CD207基因重组真核表达质粒并在草鱼DCs中成功表达。采用逆转录-聚合酶链式反应 (RT-PCR)技术从草鱼DCs中获得CD8α、CD207开放阅读框序列 (ORF)，分别插入真核表达质粒pcDNA3.1，构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-CD8α、pcDNA3.1-CD207；经测序鉴定正确后，采用脂质体法将重组真核表达质粒分别转染至草鱼树突状细胞，经细胞免疫荧光技术和蛋白免疫印迹 (Western blot) 法验证CD8α、CD207的表达。结果显示，在蛋白免疫印迹实验中CD8α、CD207蛋白可正常表达，且大小与预测结果一致。细胞免疫荧光结果显示，CD8α、CD207蛋白主要在草鱼DCs的细胞膜上表达。本研究成功构建pcDNA3.1-CD8α、pcDNA3.1-CD207重组真核表达质粒，为后续研究CD8α、CD207基因在DCs中的作用机制奠定了基础。

摘要:为探究益生菌对氨氮胁迫下半滑舌鳎的非特异性免疫酶活、血液生化指标及相关基因表达是否具有调节作用，实验首先选用枯草芽孢杆菌Y2益生菌对半滑舌鳎进行饲喂，然后对半滑舌鳎进行氨氮胁迫，胁迫过程中持续饲喂Y2并对相关指标进行监测。其中宏观生长指标结果显示，氨氮胁迫组半滑舌鳎体质量、体长低于非氨氮胁迫组，在氨氮胁迫及非氨氮胁迫条件下Y2组舌鳎体质量、体长高于空白对照组。免疫酶活测定结果显示，氨氮胁迫后半滑舌鳎血清过氧化氢酶 (CAT)、酸性磷酸酶 (ACP)、过氧化物酶 (POD)、碱性磷酸酶 (AKP)活性均有所升高；在氨氮胁迫及非氨氮胁迫条件下饲喂Y2菌株的2组ACP、CAT和POD活性均高于其相应对空白照组。血液相关生化指标结果显示，非氨氮胁迫Y2组半滑舌鳎血清中白蛋白 (ALB)和球蛋白 (GLB)含量略高于空白对照组，白蛋白与球蛋白比值 (A/G) 较高，甘油三酯 (TG)、胆固醇 (CHO)含量差异较小；氨氮胁迫对照组舌鳎血清中ALB、CHO含量下降，GLB含量略有升高，血清中总蛋白 (TP)及总脂肪呈下降趋势，且A/G降低，而氨氮胁迫Y2组比空白组舌鳎血清中ALB、TG及CHO含量升高，导致A/G升高。同时氨氮胁迫使血清中丙二醛 (MDA)、谷草转氨酶 (AST)及谷丙转氨酶 (ALT)的含量显著升高，Y2在氨氮胁迫及非氨氮胁迫条件下均可以降低MDA、AST及ALT的含量。相关基因表达结果显示，氨氮胁迫使半滑舌鳎肠、肝脏、肌肉及鳃组织热休克蛋白基因 (HSP70)及血红蛋白α1基因 (Hb-α1)表达量升高，且HSP70的表达量Y2组高于空白组，其中在肝脏组织中上调最明显，相反，氨氮胁迫下Y2组的Hb-α1表达量下降，在肝脏及肌肉组织中下降最明显。此外氨氮胁迫使半滑舌鳎相应组织中生长因子基因 (IGF)的表达量均降低，但在氨氮及非氨氮胁迫条件下Y2组的IGF表达量均高于其空白对照组。综上，Y2可以改善氨氮胁迫对半滑舌鳎的免疫能力、血液生化指标、氧气运输、应激能力及生长等造成的多方面影响，降低氨氮胁迫对半滑舌鳎造成的负面作用，在水产养殖行业中具有良好的应用前景。

摘要:为研究赤点石斑鱼Toll样受体 (TLRs)的进化、分布及表达模式，本实验基于已公开的赤点石斑鱼基因组和转录组数据，利用Blast、系统进化与共线性等生物信息学方法，分析赤点石斑鱼TLRs基因家族的系统进化、染色体分布及在各组织中的表达模式。结果显示，在赤点石斑鱼中共鉴定出17个TLR基因，这些基因分属于5个亚家族 (TLR1、TLR3、TLR5、TLR7和TLR11)，分别分布在24条染色体中的11条染色体上；17个TLR基因在赤点石斑鱼不同组织中具有不同的表达模式，然而，位于相同染色体上的TLR基因的不同拷贝则存在相似的表达模式。其中EaTLR18-1与EaTLR18-2均位于9号染色体上，二者的表达模式高度相似，均在心脏中高表达；同位于20号染色体上的EaTLR2-1a与EaTLR2-1b的表达模式也高度相似，均在脑中高表达；EaTLR5M与EaTLR5S同位于14号染色体上，二者不仅具有高度相似的LRR结构域，且在不同组织中的表达水平也高度相似；而位于18号染色体的EaTLR7与EaTLR8和位于4号染色体的EaTLR2-2与EaTLR3，其表达模式却存在明显差异。研究结果可为鱼类Toll样受体系统进化分析提供参考数据，也为进一步研究赤点石斑鱼Toll样受体基因的功能奠定基础。

摘要:为寻找并丰富溶藻弧菌噬菌体资源，实验以溶藻弧菌VAHN1为宿主菌，采用双层平板法从海南虾塘水样及福建海产品样本中分离溶藻弧菌噬菌体。通过透射电镜、限制性内切酶及构建发育树等方法对所获溶藻弧菌噬菌体进行分类鉴定；同时分析其生理生化性能。结果显示，本研究分离获得2株溶藻弧菌噬菌体VAP9与VAP21，其噬菌斑均清晰透亮，直径约1.5~2.0 mm。2株噬菌体核酸均为双链DNA，于透射电镜下可见其头部均呈正二十面体结构，2株噬菌体均属肌尾噬菌体科。噬菌体VAP9与VAP21对理化环境具有良好的耐受性；VAP9最适pH为6~8，VAP21最适pH为7~11；2株噬菌体可耐受通用杀菌浓度的过氧乙酸，且对氯仿与乙醚不敏感，同时对紫外线具有一定耐受性。2株噬菌体的最佳感染复数均为0.001，对供试溶藻弧菌的裂解率达95.2%，可裂解部分副溶血性弧菌，但无法裂解除溶藻弧菌与副溶血性弧菌外的弧菌属、葡萄球菌属、假单胞菌属等其他种属的供试细菌。噬菌体VAP9与VAP21可高效抑制溶藻弧菌VAHN1的生长，且2株噬菌体的混合制剂对溶藻弧菌的抑制效果优于单株噬菌体。将噬菌体VAP9及VAP21保守蛋白序列于NCBI数据库上比对，发现2株噬菌体与其他噬菌体间同源性较低，因此噬菌体VAP9及VAP21很可能为2株新发现的肌尾科噬菌体。

摘要:为了解钙调蛋白在刺激隐核虫生长发育过程中的作用，实验从刺激隐核虫滋养体cDNA文库中克隆出钙调蛋白基因 (cicam)，优化密码子后人工合成开放阅读框 (ORF)，构建成重组质粒pGEX-4T-1/cicam，将其转化至大肠杆菌后，通过ZYM-5052自诱导培养基诱导重组子表达。用谷胱甘肽琼脂糖凝胶及凝血酶纯化重组蛋白rCiCaM，并用其免疫小鼠BALB/c株获得多克隆抗体。分别用逆转录PCR和免疫印迹实验检测cicam及其编码蛋白CiCaM在各期虫体中的表达。通过间接荧光抗体实验检测CiCaM在幼虫中的定位。通过覆盖印迹实验 (Blot overlay assay)初步探讨了重组蛋白rCiCaM结合重组肌动蛋白解聚因子的活性。结果显示，cicam的ORF为450 bp，编码含149个氨基酸的肽链，其分子量预测值为16.9 ku；原核表达的融合蛋白GST-rCiCaM及切除GST标签的rCiCaM的表观分子量分别为43和16.9 ku，均与预测值相符；cicam在刺激隐核虫的各个发育阶段都有稳定的表达，其表达产物CiCaM的分子量与预测值相符；在幼虫细胞内CiCaM在胞质中均有分布，尤其在4个大核周围及胞口部位更为富集；CiCaM与CiADF₂之间可能发生Ca²⁺依赖性的相互作用。该研究丰富了刺激隐核虫病原分子生物学知识，为刺激隐核虫病防治方法的开发提供参考。

摘要:为研究草鱼补体蛋白5a (complement component 5a，C5a)、补体蛋白5a受体 (C5a receptor，C5aR) 和凝血因子Ⅱ (blood coagulation factor Ⅱ，FⅡ)在感染草鱼呼肠孤病毒 (grass carp reovirus，GCRV)时的蛋白表达和相互作用，针对草鱼C5a和FⅡ蛋白构建了原核表达体系、针对草鱼C5aR蛋白构建C5aR-KLH偶联物，纯化蛋白，免疫日本大耳白兔制备3种蛋白的多克隆抗体。用蛋白质印迹(Western blot)、免疫共沉淀 (Co-IP)和拉下 (pull down)实验检测3种蛋白表达与互作关系，Western blot结果显示，C5a和C5aR在健康草鱼的肝脏、脾脏、肾脏、头肾、肠、鳃和肌肉中均有蛋白表达，FⅡ在肝脏、脾脏和肠中表达，而在肾脏、头肾、鳃和肌肉中不表达；在感染GCRV的草鱼肝脏组织中C5a、C5aR和FⅡ蛋白均随病程进展呈现上升趋势。Co-IP结果显示，在GCRV处理后，C5a、C5aR和FⅡ蛋白具有相互作用关系。pull down结果显示，C5a pull down共鉴定得到C3、RIG-I等28种候选蛋白，C5aR pull down共鉴定得到转醛醇酶、巨球蛋白等24种候选蛋白。该研究为深入探讨C5a、C5aR和FⅡ互作调控关系以及进一步探索补体和凝血级联系统中3个关联蛋白响应GCRV感染的作用机制奠定了基础。

摘要:为精确定位鲍疱疹病毒 (HaHV-1)在宿主不同组织器官中的分布，明确HaHV-1的组织亲嗜性和侵染进程，实验基于环介导等温扩增技术 (LAMP)和原位杂交技术建立了HaHV-1的原位LAMP检测方法。利用该方法研究了HaHV-1人工感染实验不同时间节点，病毒在杂色鲍主要器官的分布规律和组织亲嗜性。并对已报道的HaHV-1 LAMP扩增引物进行优化，实现对载玻片上原位固定靶组织内病毒DNA的稳定、特异扩增，筛选最佳显色时间等原位杂交反应条件，最后通过免疫酶标技术分析HaHV-1在组织样本内的分布情况。结果显示，HaHV-1原位LAMP检测方法最适显色时间为60 min。利用该方法对攻毒后24、36、48、60和72 h，HaHV-1在杂色鲍外套膜、鳃、肝胰腺和腹足神经节4种样本的组织分布情况进行检测和分析。病毒阳性信号最早于36 h出现在腹足神经节，48 h 在部分外套膜样本中观察到病毒阳性信号，分布局限于外周神经中。在感染实验后期，病毒阳性信号出现在肝胰腺结缔组织中。病毒阳性信号出现的部位常有大量细胞渗出和浸润，渗出的细胞中可见被病毒感染的血淋巴细胞。本研究建立的HaHV-1原位LAMP检测方法，同步实现了高灵敏度和精确定位的功能。该检测方法适用于病毒感染的确诊、不同组织器官的亲嗜性、病毒侵染途径和致病机理等相关研究。

摘要:为解析鲤质子转运载体15a2 (Slc15a2)在嗜水气单胞菌侵染过程中对机体免疫应答机制的影响，实验通过制备鼠源Slc15a2-1和Slc15a2-2多克隆抗体，采用酶联免疫吸附测定 (ELISA) 技术检测嗜水气单胞菌感染后鲤血清中Slc15a2-1和Slc15a2-2蛋白表达变化。结果显示，①感染后2个拷贝的最高蛋白表达水平与空白对照组相比，分别增加了4.81和2.48倍；与Slc15a2-1相比Slc15a2-2的表达量从0~48 h一直处于较高表达水平。②从整体来看，Slc15a2的2个拷贝具有相似的表达趋势，均为先升高后降低、再升高再降低；但Slc15a2-1在3 h达到第1个表达高峰，而Slc15a2-2则在6 h达到第1个表达高峰。③ 6~24 h的4个时期中，Slc15a2-1和Slc15a2-2蛋白表达呈现互补的表达趋势，即在同一时期一个拷贝的表达量显著下降，另一个拷贝的表达量显著升高，但总体维持较高表达水平。结果表明，本实验制备的鼠源Slc15a2-1和Slc15a2-2多克隆抗体具有较高的亲和力和特异性，当鲤受到嗜水气单胞菌侵染后，2个拷贝整体具有相似的表达趋势，说明可能具有相似的基因功能；与Slc15a2-1相比，Slc15a2-2在0~48 h之间具有显著的高表达量，推测该基因为2个拷贝中的主效基因，并且6~24 h时，2个拷贝一直呈现互补的表达方式，导致Slc15a2表达量维持在高水平，面对病原侵害时能做有效响应。本研究为深入了解鲤Slc15a2的免疫防御机制提供一定的研究基础。