摘要:为了调查广东省惠州、肇庆、珠海、湛江4个吉富罗非鱼主养区链球菌病的流行情况和耐药性,并进一步分析β-内酰胺酶基因与青霉素类药物的耐药性关系。本实验通过传统的方法对菌株进行分离纯化,扩增特异性基因cfb以及16s rDNA对各菌株进行鉴定; 采用k-b法测定分离菌株的药物敏感性;通过PCR检测β-内酰胺酶类基因在分离菌株中的分布情况,并用Statistic6.0统计分析各β-内酰胺酶基因与青霉素类药物的耐药关系。实验结果表明,吉富罗非鱼无乳链球菌的阳性率从高到低的顺序为惠州(46.46%) >湛江(43.24%) >肇庆(17.30%) >珠海(4.17%);药敏结果显示各地区无乳链球菌分离株对青霉素(耐药率为94.29%)和磺胺二甲基嘧啶(耐药率为86.40%) 普遍耐药,对恩诺沙星最为敏感(耐药率为3.99%);β-内酰胺酶基因分布与细菌耐药性统计结果显示,无乳链球菌基因组中的9个β-内酰胺酶基因在各分离菌株中的分布呈高度多态性,其中SAG0658基因与氨苄青霉素抗性显著相关,提示SAG0658基因在无乳链球菌耐氨苄青霉素过程中发挥主要作用;此外,9个β-内酰胺酶基因与青霉素抗性无相关性,说明其在菌株对青霉素耐药过程中并未发挥明显作用,提示分离菌株对青霉素的耐药性可能依赖其他途径。

摘要:为评价鲖爱德华菌口服微球疫苗对斑点鲖的免疫效果,实验以天然高分子聚合物海藻酸钠和鲖爱德华菌灭活疫苗为材料,制备鲖爱德华菌口服微球疫苗。将实验动物随机分为鲖爱德华菌微球疫苗组、鲖爱德华菌灭活疫苗组、空微球组和对照组,以拌料口服方式进行免疫,通过检测血清中溶菌酶活力、总超氧化物歧化酶(T-SOD)活力、补体替代途径(ACH50)活性等非特异性免疫指标,抗体效价以及相对免疫保护率评价疫苗免疫效果,采用荧光定量PCR检测口服疫苗对斑点鲖免疫相关基因表达量的影响。结果显示,鲖爱德华菌口服微球疫苗能够较长时间增强斑点鲖非特异性免疫功能;血清凝集效价于第5周达到峰值,为1:16,免疫后第7周仍可检测到特异性抗体;口服鲖爱德华菌微球疫苗的斑点鲖获得的抗鲖爱德华菌相对免疫保护率为60.7%,远高于灭活疫苗组(14.3%)及空微球组(10.7%);荧光定量分析结果显示,攻毒后48 h相比攻毒前各免疫基因表达量均有上调,鲖爱德华菌微球疫苗对受免鱼肾脏、脾脏中免疫基因的表达影响尤为明显。结果表明,鲖爱德华菌口服微球疫苗能增强斑点鲖非特异性免疫功能,对鲖爱德华菌病起到一定的预防作用。

摘要:为探讨广西南宁市、浦北县和玉林市暴发性死亡胡子鲶的病原菌及其所携带6种毒力基因对其致病力的影响,用常规方法从病鱼的心脏、肝脏等部位分离细菌,人工感染实验确定病原菌的致病性,以API 20NE生化鉴定和16S rRNA分子鉴定相结合的方法对病原菌进行鉴定,采用PCR扩增法检测病原菌的6种毒力基因携带情况。结果显示,从患病鱼中共分离到5株病原菌,其中嗜水气单胞菌3株,温和气单胞菌2株。3株嗜水气单胞菌与标准菌株Aeromonas hydrophila ATCC 7966(CP000462)的亲缘关系最近,相似性均为99.8%,2株温和气单胞菌与标准菌株Aeromonas sobria NO.106(AB472903.1)的亲缘关系最近,相似性均达99.9%。6种毒力基因在5株病原菌中的阳性检出率分别为Act和Aer基因100%, ahal、hly和Alt基因均为80%, ahp基因仅20%;毒力基因型共3种,在5株气单胞菌中分布情况为Act⁺ahal⁺hly⁺Alt⁺ahp^-Aer⁺ 3株,占实验菌株的60%,为主要的毒力基因,Act⁺ahal⁺hly⁺Alt⁺ahp⁺Aer⁺和Act⁺ahal^-hly^-Alt^-ahp^-Aer⁺各1株,各占20%。携带全部所检6种毒力基因的菌株致病力最强,只携带Act和Aer 2种毒力基因的菌株致病力最弱。ahp基因在菌株的致病力中起重要作用,病原菌的致病力是多种毒力基因协同作用的结果。

摘要:采用高效液相色谱法,研究了复方噁喹酸粉药饵投喂在凡纳滨对虾体内药动学和组织中消除规律,同时检测了噁喹酸对对虾源弧菌的最小抑菌浓度(MIC),建立了药动/药效(PK/PD)关系,提出了用药方案和休药期建议。结果显示,复方噁喹酸粉拌饵投喂给药,噁喹酸给药剂量为30 mg/kg(体质量),凡纳滨对虾血浆噁喹酸浓度—时间关系曲线均符合一级吸收二室开放动力学模型。血淋巴中噁喹酸达峰浓度(C_max)、达峰时间(T_max)、曲线下面积(AUC_0-24)和消除半衰期(t_1/2z)分别为14.70 mg/L、2 h、244.6 mg/(L·h)和18.56 h;肌肉、肝胰腺和鳃的峰浓度(C_max)分别为4.11、17.20和7.01 mg/kg,消除半衰期(t_1/2z)分别为10.71、12.31和16.75 h。噁喹酸对132株弧菌的MIC主要分布在0.15~1.25μg/mL,MIC₅₀和MIC₉₀分别为0.62和1.25 μg/mL。PK/PD相互关系参数C_max/MIC₉₀和AUC0-24/MIC₉₀分别为11.76和195.7。研究表明,噁喹酸以30 mg/(kg体质量)剂量药饵给药,凡纳滨对虾能很好地吸收噁喹酸,可以有效地防治弧菌引起的细菌性疾病。

摘要:为探明鱼类黏膜相关淋巴组织中黏液细胞对疫苗免疫的应答特性,本研究利用组织学和组织化学技术,研究了浸泡免疫灭活迟钝爱德华氏菌前后牙鲆皮肤、鳃、前肠、中肠和后肠中黏液细胞数量和特性的时序变化。苏木精-曙红(HE)、阿尔新蓝-过碘酸雪夫氏(AB-PAS)染色结果显示,免疫前皮肤主要分布含中性黏多糖的Ⅰ型黏液细胞以及含中性黏多糖和少量酸性黏多糖的Ⅲ型黏液细胞,鳃中可观察到Ⅰ、Ⅲ型以及含酸性黏多糖和少量中性黏多糖的Ⅳ型黏液细胞,前肠中主要分布Ⅰ型黏液细胞,中肠、后肠上皮中可观察到Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型和含酸性黏多糖的Ⅱ型黏液细胞。免疫后,牙鲆黏膜免疫相关淋巴组织中黏液细胞总量随时间呈现先增多后减少趋势,后肠在第5天达到峰值,其他于第3天达到峰值;免疫后各组织中Ⅰ型黏液细胞数量减少,含酸性黏多糖成分的Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ型黏液细胞数量显著增多,表明疫苗免疫诱导黏液细胞成分由中性黏多糖向酸性黏多糖转变。pH 2.5和pH 1.0条件下AB染色结果显示,免疫后黏膜相关淋巴组织中酸性黏液细胞数量增多,且多数为硫酸化酸性黏液细胞。本研究结果为鱼类黏液的免疫防御功能及黏液细胞在鱼类黏膜免疫中的作用提供了理论依据。

摘要:近年来克氏原螯虾的养殖受到WSSV的威胁,病毒在宿主组织中的绝对定量对于了解病毒的致病性具有重要意义,但克氏原螯虾组织中WSSV的绝对定量分布还有待研究。实验调查了湖北省5个主养区克氏原螯虾WSSV的感染率,结果表明80%以上克氏原螯虾都携带有WSSV。采用WSSV-VP28蛋白特异性抗体对克氏原螯虾提取蛋白进行Western Blot检测,在WSSV-PCR阳性样品中可检测到VP28特异性条带,在WSSV-PCR阴性样品中没有检测到相应条带。采用实验室建立的WSSV绝对定量PCR方法,对携带病毒的克氏原螯虾6个组织(鳃、胃、肠、血淋巴细胞、肝胰腺和心脏)进行检测。结果表明, 在鳃、胃和肠可检测到较多病毒量(约10⁸拷贝/mg), 其次是血淋巴细胞 (10⁷拷贝/mg)、肝胰腺(10⁶拷贝/mg),在心脏中病毒的含量最低(10³拷贝/mg),表明病毒的复制存在组织特异性。结果显示WSSV主要存在于消化系统中,预示着克氏原螯虾可能主要在摄食过程中感染WSSV; 不同地区克氏原螯虾组织病毒携带量表现出一定差异,预示着WSSV感染可能受到环境因素的影响。

摘要:为了建立适用于OsHV-1不同变异株的检测方法,在牡蛎疱疹病毒(OsHV-1)3个变异株全基因组序列比对的基础上,筛选到牡蛎疱疹病毒基因组中高度保守的DNA聚合酶(DNA polymerase)基因,据此设计巢式PCR引物,优化PCR反应体系和条件,建立了基于OsHV-1 DNA聚合酶基因的巢氏PCR检测方法(P-nPCR检测方法),利用P-nPCR与CnPCR检测方法对不同年份和宿主来源的OsHV-1疑似感染样本进行检测。结果显示,PnPCR检测方法能稳定地检出100 拷贝/μL的病毒DNA;P-nPCR较C-nPCR检测方法具有更强的特异性和更高的检出率。研究表明,本研究建立的P-nPCR检测方法适用于OsHV-1不同变异株的检测,可为该病毒的检测和流行病学调查提供可靠的技术支持。

摘要:混养的异育银鲫和鲢鱼种大批死亡,为明确发病死亡的病原和组织损伤并提供相关的疾病防控措施,进行了病鱼肉眼和显微镜检查、细菌学检测、病毒学检测、组织病理和药敏试验研究。结果发现,除在患病鱼体表偶然发现有少量不会引起充血等症状的杯体虫和车轮虫外,未在体内外发现其他寄生虫和真菌类病原;通过细菌分离、人工回感试验、生理生化特性和16S rRNA基因序列分析,从患病异育银鲫和鲢分离到的致病菌株均为嗜水气单胞菌;根据异育银鲫和鲢病毒性疾病的现状,使用鲤疱疹病毒2型(Cyprinid herpesvirus 2, CyHV-2)DNA聚合酶基因的特异性引物分别对自然发病的异育银鲫和鲢进行PCR检测,只有异育银鲫检测到CyHV-2,分别用它们的除菌组织上清液进行人工感染试验,只有异育银鲫出现充血症状和死亡现象;由此得出嗜水气单胞菌是异育银鲫和鲢发病死亡的主要病原,CyHV-2是异育银鲫混合感染的次要病原。患病鲢与患病异育银鲫呈现出类似的组织病理现象,又有一些各自特有的组织病理表现,单纯细菌感染的鲢轻度病变以细胞颗粒变性为主,坏死细胞以核溶解为主,细菌和病毒混合感染的异育银鲫肝脏轻度病变以细胞滴状玻璃样变的变性为主,坏死组织细胞以核固缩和核碎裂为主,在肾脏和脾脏出现染色质边集于核膜的肿大细胞核,主要组织器官出现从变性到坏死的病理变化过程,最终失去应有的功能而死亡。依据药敏试验结果,建议内服诺氟沙星和氟苯尼考等抗生素防治本病的嗜水气单胞菌感染,混合感染CyHV-2的异育银鲫可以通过注射CyHV-2疫苗和生态养殖的方法控制和减少该病毒病感染和发展。

摘要:为检测罗非鱼源无乳链球菌兼职蛋白EF-Tu(延伸因子Tu, Elongation Factor Tu)的抗原性,本实验克隆了罗非鱼源无乳链球菌 HN0303的EF-Tu基因序列,并进行了蛋白相关性质的预测和系统发育树的构建。通过原核表达得到EF-Tu重组蛋白,同时利用纯化的蛋白免疫家兔获得多克隆兔抗EF-Tu重组蛋白血清以用于EF-Tu蛋白抗原性检测。结果显示,罗非鱼源无乳链球菌HN0303 EF-Tu基因有1个由1197个碱基组成的ORF,编码398个氨基酸。生物信息学分析显示其分子式为C₁₉₃₃H₃₀₉₆N₅₃₂O₆₁₅S₁₁,分子质量为43.981 ku,理论等电点为4.749;具有多个磷酸化位点,不具有信号肽和跨膜区域;具有保守的EFTu结构域、EF-Tu-II结构域和EF-Tu-III结构域,且与其他来源无乳链球菌的EF-Tu蛋白具有很高的同源性;具有较高的抗原指数,表明其可形成多个抗原表位。SDS-PAGE检测发现,诱导表达的重组蛋白以包涵体的形式出现在沉淀中,大小约为66.4 ku。WesternBlot分析表明,兔抗EF-Tu重组蛋白血清能分别特异性结合菌体蛋白和EF-Tu重组蛋白。同时使用兔抗EF-Tu重组蛋白血清封闭罗非鱼源无乳链球菌 HN0303表面的EF-Tu蛋白后,无乳链球菌 HN0303粘附EPC(Epithelioma papulosum cyprini,鲤鱼上皮细胞)的能力下降了79.99%±2.43%。本研究表明,原核表达的罗非鱼源无乳链球菌EF-Tu重组蛋白具备较好的抗原性,用其制备的兔抗血清能够较好地抑制罗非鱼源无乳链球菌的粘附,推测其可能为罗非鱼源无乳链球菌亚单位疫苗的候选蛋白。

摘要:为了研究鳜IRAK4生物学特性及其在抗病毒免疫应答中的作用,根据鳜转录组数据中筛选出的IRAK4 unigene序列设计引物,利用 SMART-RACE 技术克隆得到CDS全长为1389 bp的cDNA (命名为ScIRAK),编码462个氨基酸,含有1个N端死亡结构域和1个保守的中央蛋白激酶结构域。采用荧光定量RT-PCR方法分析了ScIRAK4在健康鳜各组织中的表达差异及病毒感染后在脾脏中的表达变化,结果显示,健康鳜中ScIRAK4在肝脏中表达量最大,与其他组织差异显著,而在血液、脑和胃中表达量最低;传染性脾肾坏死病毒(infectious spleen and kidney necrosis virus, ISKNV)感染鳜后ScIRAK4的表达量呈现下调趋势,24 h脾脏中的表达量达到最低,为对照组的45%;而鳜弹状病毒 (sinipercachuatsi rhabdovirus,SCRV)感染鳜后ScIRAK4的表达量呈现上调趋势,12 h脾脏中ScIRAK4的表达量达到最高,为对照组的8.17倍,表明ScIRAK4在抗ISKNV和SCRV的免疫应答中可能发挥不同的作用。本研究为进一步揭示ScIRAK4的抗病毒免疫反应机制提供了依据。

摘要:为探究高水温对尼罗罗非鱼无乳链球菌病暴发的影响, 以体质量为(62.0±3.33)g的尼罗罗非鱼为研究对象,设置生长最适宜组(29 ℃)和高温应激组(33 ℃)2个处理水平,暂养7 d后分别进行人工感染实验统计累计死亡率,并于攻毒后0、12、24、48、96和120 h采集血液和组织样本,开展高温应激下无乳链球菌感染对尼罗罗非鱼血清生化指标和组织病理影响的研究。结果显示,水温33 ℃高温应激组尼罗罗非鱼累计死亡率显著高于29 ℃组;谷丙转氨酶(ALT)活性在感染96 h之后33 ℃组的值显著高于29 ℃组;谷草转氨酶(AST)活性在感染48 h之后33 ℃组的值显著高于29 ℃组;钾(K⁺)和钠(Na⁺)含量感染120 h时29 ℃组的值和攻毒前都没有显著性差异,而33 ℃组分别显著高于和低于攻毒前;肌酐(CREA)含量在感染12 h以后33 ℃组的值都显著高于29 ℃组;白蛋白/球蛋白(A/G)的值在120 h时33 ℃组的值显著低于29 ℃组;血清碱性磷酸酶(AKP)活性29 ℃组随时间延长而升高,33 ℃组则先升高后降低,但33 ℃组的达峰时间更短;超氧化物歧化酶(SOD)活性的变化趋势都是先升高后降低再升高;组织病理学观察显示高温应激使肝细胞排列紊乱,索状结构不清,脾脏和肾脏轻微充血;感染12 h后脾脏均严重充血,感染24 h后脾脏结构均被破坏,呈淀粉样变性,坏死;感染48 h后肾小球均发生萎缩,肾小管上皮细胞变性、坏死;33 ℃组鱼的肝脏感染96 h后严重脂肪变性和细胞内玻璃样变性,而29 ℃组鱼的肝脏在感染120 h后才发生相似的病理变化。研究表明高温应激抑制了鱼体免疫系统,降低了尼罗罗非鱼对无乳链球菌的抵抗力,脾脏对无乳链球菌感染响应最快,高温应激使病原菌感染对肝脏损伤更为迅速,感染后期受损更严重。

摘要:为建立针对Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒(GCRV)的血清学检测方法,分别构建了GCRVJX02 株外衣壳蛋白VP4、VP35的原核重组表达质粒PGEX-4T-3-S6、PGEX-4T-3-S11,用纯化的重组蛋白rVP4、rVP35分别免疫小鼠制得相应的多克隆抗体,用间接ELISA方法测定2种抗体的效价,用Western Blot鉴定抗体的特异性。SDS-PAGE分析细菌表达的rVP4、rVP35大小分别约为98ku和61ku,且都主要以包涵体的形式存在;间接ELISA方法测定制备的抗体效价分别约为1:4×10⁵和1:10⁶;Western Blot结果显示,制备的2种多克隆抗体都既能够识别原核表达的重组蛋白,又能够识别JX02毒株上的对应蛋白,并且发现感染JX02的草鱼血清中存在结合VP4、VP35的相应抗体。本研究制备的2种多克隆抗体都具有良好的生物学特性,并且这2种重组蛋白作为相应抗体捕获原可以用于通过检测抗病毒抗体来确诊草鱼是否感染Ⅱ型GCRV。本研究将为GCRV主要流行株血清学检测方法的建立以及VP4、VP35蛋白相关功能研究奠定基础。

摘要:为了研究维氏气单胞菌及其胞外产物的致病机制对预防和治疗斑点鲖维氏气单胞菌病的作用。通过对一株高致病性斑点鲖源维氏气单胞菌胞外产物(extracellular product,ECP)的提取并结合体内外实验研究其酶活性与致病性,以期为维氏气单胞菌的致病机制研究提供新思路。采用饱和硫酸铵沉淀法,对一株高致病性的斑点鲖源维氏气单胞菌的ECP进行了提取,将其进行浓度检测、SDS-PAGE分析和酶活测定;并将提取的ECP攻毒斑点鲖,通过病理学分析研究其致病机制。提取的ECP经考马斯亮蓝试剂盒确定其浓度为0.743 mg/mL; SDS-PAGE分析发现该ECP类型丰富,分子大小主要集中在20.0~33.0 ku。运用琼脂平板扩散法对ECP中主要毒力和代谢相关酶活性进行体外测定,发现ECP具有脂酶、蛋白酶、卵磷脂酶、DNA酶和溶血活性,不具有淀粉酶、明胶酶、脲酶活性;并对与毒力密切相关的溶血活性进行了进一步的溶血谱绘制,发现ECP对其他多种动物红细胞都有溶血活性,对鱼类红细胞溶血性较强,但对鸡、鸭红细胞无溶血活性。 ECP攻毒健康斑点鲖后,发现其具有明显致病性,死亡率高达100%。病鱼大体病理变化为体表黏液增多,出现褪色斑以及不同程度的出血斑;眼球充血;肛门红肿外凸;剖检病变表现:鳃丝充血肿胀、肝脏肿大、散在少量出血点,脾脏肿大暗红,肠道扩张、肠壁变薄、肠腔内有大量黄色黏液。组织学病变主要表现为肝细胞变性、坏死;脾脏淋巴细胞减少,大量结缔组织增生;胃、肠道黏膜上皮坏死脱落。该株维氏气单胞菌的胞外产物具有多种酶活性,且对斑点鲖具有明显的致病性,推测该胞外产物在维氏气单胞菌入侵、感染甚至致死斑点鲖过程中都发挥了重要作用。

摘要:为了建立鳜传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)疫苗抗原含量的ELISA检测方法,制备了3株抗ISKNV主衣壳蛋白(MCP)的单克隆抗体,鉴定了其生物学特性。将大肠杆菌表达的重组MCP纯化复性后,连续3次免疫BALB/c小鼠,然后将免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合,经过克隆、筛选,获得3株能稳定分泌抗ISKNV MCP蛋白的单克隆抗体阳性细胞株,分别命名为5F1、3D9和5B4,均为IgG1亚型。间接ELISA实验表明,3株单抗可特异性识别ISKNV,与鳜弹状病毒、大鲵虹彩病毒等无交叉反应。将5F1株免疫小鼠后制备腹水,以重组MCP和ISKNV细胞培养物上清液为检测抗原,ELISA检测腹水效价分别为1:51 200和1:400。间接免疫荧光(IFA)和Western Blotting鉴定结果显示,5F1能够与ISKNV病毒发生特异性反应,并初步确定5F1单抗株制备的腹水用于IFA的使用浓度为1:200、Western Blotting的使用浓度为1:1000。结果证实,成功制备了抗ISKNV MCP的单克隆抗体,可特异性识别ISKNV病毒粒子和MCP蛋白,为建立ISKNV疫苗抗原含量检测方法奠定了基础。

摘要:为探明牡蛎疱疹病毒(OsHV-1)对魁蚶的致病性,本研究使用发病魁蚶组织制作病毒悬液进行感染实验。感染实验分为空白组、阴性悬液注射组和病毒悬液注射组,并使用实时定量PCR法对感染后魁蚶体内病毒的时空分布进行检测。实验结果显示,空白组和阴性悬液组魁蚶感染后未检测到病毒粒子,病毒悬液注射组魁蚶经人工感染后,各部位病毒含量均呈先上升再下降随后又上升的趋势,最终达到10⁶拷贝/ng DNA左右。通过电镜观察,在感染魁蚶的鳃、肝胰腺、外套膜中出现染色质边缘化甚至消失,细胞核肿胀、溶解,核仁消失,核膜扩张、不清晰,线粒体肿大,脊崩解,核糖体脱落等一系列细胞病理变化。在其细胞核和细胞质中均能发现大量直径为90~110 nm球形病毒粒子,该病毒粒子具囊膜,囊膜内可见均匀高电子密度的核衣壳,与自然发病魁蚶负染电镜中的病毒粒子形态相同。研究结果表明,OsHV-1可以感染魁蚶并与魁蚶大规模死亡有直接相关关系;魁蚶感染OsHV-1后机体产生应激反应,对OsHV-1有一定抑制作用,但其作用机制还有待进一步实验验证。

摘要:为研究Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒外纤维蛋白VP56与宿主蛋白的相互作用,实验采用酵母双杂交Gal4系统鉴定与VP56相互作用的草鱼蛋白。首先利用RT-PCR技术从Ⅱ型GCRV感染的草鱼肾细胞中扩增目的基因VP56,构建pGBKT7-VP56诱饵表达载体;在酵母菌株中检测其自激活性后,以VP56为诱饵在草鱼酵母双杂交文库中筛选阳性菌株,并对阳性克隆的序列进行分析。实验也克隆了草鱼JAM-A (GcJAM-A)基因, 并构建pGADT7-GcJAM-A载体,在酵母中研究草鱼GcJAM-A与病毒蛋白VP56相互作用的可能性。研究表明构建的诱饵质粒pGBKT7-VP56无自激活作用,可以应用于酵母双杂交筛选;从草鱼肾细胞文库中筛选得到9株阳性克隆,基因测序及序列分析确定其中包含草鱼7个细胞内蛋白和1个细胞外基质蛋白;VP56蛋白与GcJAM-A蛋白在酵母中不能发生相互作用。本研究初步确定了与Ⅱ型GCRV蛋白VP56存在潜在相互作用的宿主蛋白,为深入探讨VP56蛋白在Ⅱ型GCRV感染宿主过程中的生物学功能奠定了基础。

摘要:为了查明鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)的理化与生物学特性以及病毒在细胞内的超微形态发生过程,利用新建立的对CyHV-2敏感的异育银鲫脑组织细胞系(GiCB),对CyHV-2的理化及生物学特性进行了详细研究,比较了不同来源鱼类细胞系对CyHV-2感染的敏感性,并对体外培养细胞中CyHV-2病毒粒子及其超微形态发生过程进行了电镜观察。结果显示,CyHV-2对热、酸、碱、有机溶剂和冻融敏感;常用鱼类细胞系EPC、RTG-2、Koi-Fin、CIK、CCK、PF-Fin对CyHV-2的感染不敏感,特异性巢式PCR检测盲传至第7代CyHV-2细胞培养物,结果均为阴性;CyHV-2在GiCB细胞中的增殖动态研究结果表明:病毒感染细胞经过12 h的隐晦期,24 h开始进入对数生长期,96 h病毒滴度达到最高值(10^7.52±0.26 TCID₅₀/mL),然后进入平台期;透射电子显微镜观察结果显示,CyHV-2感染细胞可分为吸附与侵入、复制与装配、成熟与释放3个主要过程,病毒进入对数生长期后,被感染细胞内可见形态典型的疱疹病毒颗粒。

摘要:为建立鱼源嗜水气单胞菌全菌蛋白图谱并进行质谱分析,利用双向电泳(2-DE)结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF-MS)技术对嗜水气单胞菌的蛋白质组学进行鉴定研究。结果显示,嗜水气单胞菌28 ℃培养12 h、三氯醋酸(TCA)/丙酮沉淀法提取全菌蛋白、等电聚焦20 000 Vh的2-DE图谱匹配率达81%;采用18 cm、pH 3-10 IPG胶条进行2-DE分析获得146个蛋白点,随机选取部分蛋白点进行肽质量指纹图谱(PMF)分析,共鉴定23个蛋白点包括膜脂蛋白、分子伴侣、30S核糖体蛋白S1、延伸因子、细胞色素C等,其中发现烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、二氢硫辛酰胺脱氢酶、精氨酸脱亚氨酶、ATP合酶α亚基、脱氧核糖核酸聚合酶亚基α、氨基甲酸激酶、腺苷酸激酶、尿苷磷酸化酶、硝基还原酶、肽酰脯氨酰异构酶共计11个代谢相关蛋白酶;基于分子功能进行蛋白分类(GO)分析,发现主要为结合(17.1%)、催化(14.3%)和转移酶(11.4%)等生物学过程。建立鱼源嗜水气单胞菌全菌蛋白图谱与部分蛋白鉴定,有助于理解嗜水气单胞菌的蛋白质组学及其分子机制。

摘要:为了解乌鳢源舒伯特气单胞菌WL-4菌株的生理生化、生长特性、致病因子等生物学特征,以及其对多种药物的敏感性,使用细菌生化鉴定仪检测菌株的生理生化特性,比较不同温度、盐度及pH条件下菌株的生长特征;通过人工回归感染分析菌株的致病性,测定相关的毒力因子并采用PCR方法扩增毒力基因;采用微量二倍稀释法测试菌株对20种抗菌药物的最小抑菌浓度。结果发现,与模式菌株(ATCC43700)相比,两菌株的大部分生理生化特性相同,16S rRNA基因比对,相似度达99. 9%;WL-4菌株的最适生长温度为30 ℃,最适生长盐度为5,最适生长pH为7;29 ℃时,腹腔注射感染乌鳢苗种的半数致死浓度(LC₅₀)为1.2×10⁶ CFU/mL;该菌株具有溶血性、蛋白酶活性和脂肪酶活性;WL-4菌株对磺胺类及酰胺醇类等8种药物具有耐药性,而对多西环素、新霉素、氨苄西林等12种药物敏感。研究表明,WL-4菌株的生物学特征与其引起的乌鳢内脏类结节病的发生情况相吻合,致病菌的药物敏感性与药物使用情况存在相关性。

摘要:为规避活病毒作参考物质存在的生物安全风险,本研究利用毕赤酵母表达系统表达了传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)的糖蛋白来制备参考蛋白,作为IHNV免疫学检测参考物质。本研究选用IHNV糖蛋白基因(IHNV-G)为目的基因,根据GenBank中IHNV全基因序列设计特异性引物,以IHNV-uk株病毒核酸为模板,通过RT-PCR获得糖蛋白基因片段, 将其克隆至真核表达载体pPICZαA, 转入毕赤酵母感受态细胞GS115中,使外源基因与酵母基因融合,通过1%甲醇诱导表达外源蛋白,SDS-PAGE分析显示获得可溶性表达蛋白,分子量大于70 ku。经Western Blot和ELISA分析,该表达产物可以被IHNV多抗特异性识别。0.1531 mg的重组蛋白与0.3125TCID₅₀ IHNV在ELISA实验中反应原性相当,-20 ℃可稳定保存2个月,说明其在一定程度上可替代病毒作为参考物质。该研究为IHNV ELISA检测试剂盒的开发奠定基础。

摘要:为探究大黄鱼MARCH5A的免疫作用,实验采用反转录PCR确认了该基因的cDNA序列。该序列全长1045 bp,包含1个长度为867 bp的开放阅读框,编码288个氨基酸;序列分析显示该蛋白含1个RINGv和4个跨膜结构域。进化树分析表明大黄鱼有11个MARCH家族蛋白(与哺乳动物相同),但鱼类存在多个亚型,MARCH5A为鱼类特有蛋白,其蛋白理化性质和三维结构均与MARCH5B存在一定的差异。荧光定量PCR分析显示,MARCH5A在健康大黄鱼的多个组织中均有表达,在血液和心脏中表达量最高,其次为鳃和脑,而在肾脏和皮肤中表达量最少。刺激隐核虫感染大黄鱼后,MARCH5A在皮肤中早期表达量显著上调,第2天为对照组的9.65倍,后期下调。在鳃、脾脏和头肾中的前期表达量也有所增加,后期下降。结果表明大黄鱼MARCH5A在抗刺激隐核虫免疫应答过程中可能发挥重要作用。

摘要:为研究体外诱导敏感嗜水气单胞菌耐药后,其敏感性变化与基因突变、外排作用的关系,实验选取对氟喹诺酮类药物敏感的养殖鱼源嗜水气单胞菌临床分离菌株为研究对象,分别在含亚抑菌浓度恩诺沙星(EN)和诺氟沙星(NF)的培养基上逐步诱导培养,以获得高耐药菌株; 对诱导菌株gryA和parC基因进行扩增和测序分析; 测定诱导菌对诱导药物和16种非诱导药物的最小抑菌浓度(MIC)及添加外排泵抑制剂N-甲基吡咯烷酮(NMP)后的MIC值变化; 并对诱导菌交叉耐药情况进行比较分析。结果发现,诱导后菌株对EN和NF的MIC分别提高了409.6和4096倍,对非诱导氟喹诺酮类药物和其他类药物的MIC也有较大变化; 药物诱导后各菌株gyrA基因和parC基因编码的氨基酸QRDRs区发生了典型的点突变: GyrA发生Ser83→Ile变化,ParC发生Ser87→Ile/Arg变化;添加NMP后,所有诱导菌株对两种药物的MIC值均有不同程度的下降; 诱导后菌株交叉耐药情况与菌株密切相关,其中3和8号诱导菌株对16种非诱导药物均无交叉耐药反应,而EN诱导菌株对氨基糖苷类和利福霉素类药物基本未产生交叉耐药反应,NF诱导菌株对除庆大霉素以外的氨基糖苷类和利福霉素类药物基本未产生交叉耐药反应,所有诱导后菌株均对四环素类和氯霉素类药物产生较严重的交叉耐药。研究表明,嗜水气单胞菌对氟喹诺酮类耐药存在靶基因位点突变及主动外排作用等多种耐药机制; 且应慎重考虑在防治耐药菌株引发病害时,交叉耐药情况对选择治疗药物的影响。

摘要:为了筛选能提高水产动物对嗜水气单胞菌抗病性的益生菌,并研究其免疫调节的作用机制。将5种乳酸菌与斑马鱼ZF-4细胞共培养后通过荧光定量PCR方法检测细胞因子NFκB、TNF-α和IL-10的表达量,并用流式细胞仪检测被嗜水气单胞菌NJ-1攻毒后的细胞凋亡率来筛选对ZF-4细胞保护性最显著的乳酸菌,将其添加至模式生物斑马鱼饲料中饲喂28 d后,用嗜水气单胞菌NJ-1攻毒并检测斑马鱼肠道中促炎性细胞因子TNF-α、IL-1β和抗炎性细胞因子IL-10的表达情况,并计算斑马鱼被攻毒后的累积死亡率。结果显示,5种乳酸菌分别与细胞共培养后,芽孢乳酸菌09.712能明显提高ZF-4细胞NFκB、TNF-α和IL-10的表达量,攻毒后细胞凋亡率降低至23.36%,与其他组相比存在显著性差异,所以选取芽孢乳酸菌09.712用于下一步实验。体内实验显示,攻毒后第1天,与对照组相比,芽孢乳酸菌09.712能显著促进斑马鱼肠道内IL-1β、TNF-α和IL-10的表达量,且随时间变化表达量减少;其中攻毒后第3天,菌饲喂组IL-1β表达量比对照组低,而IL-10表达量明显比对照组高。此外,芽孢乳酸菌09.712的饲喂显著降低斑马鱼攻毒后的死亡率。研究表明,芽孢乳酸菌09.712在体外能显著提高对细胞的保护性,在体内能诱导斑马鱼产生先天免疫应答,提高斑马鱼的免疫力,可作为预防水产动物疾病的理想选择,也为阐明乳酸菌先天性免疫调节作用提供理论基础。

摘要:为探讨芽孢杆菌潜在的淬灭靶点, 本研究通过芽孢杆菌R1与嗜水气单胞菌NJ-1共培养,并对NJ-1生物量、信号分子产生量、毒力因子基因和群体感应(QS)关键调控基因表达量进行检测。结果显示:①NJ-1单独培养时,信号分子BHL和HHL的产量与NJ-1生长趋势一致,在27 h时达到峰值并启动LuxR表达,进而调控毒力因子金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、肠毒素、气溶素和血溶素等表达,其在27~30 h时呈现峰值表达,通路QseB在27~30 h启动表达,48 h时达到峰值,而种间调控LuxS基因表达一直处于低水平状态;②与芽孢杆菌R1共培养时,仅痕量AHLs信号分子被检出,毒力因子相关基因表达量均显著下调;LuxR表达受抑制,LuxS在36 h时表达量显著上调,未影响QseB正常表达;③AHLs与R1共培养可被显著降解。研究表明,芽孢杆菌R1抑制NJ-1毒力因子相关基因表达可能与其对NJ-1多QS系统进行调控相关联。