2017, Vol. 41
鲣(Katsuwonus pelamis)隶属硬骨鱼纲(Oste-ichthyes)、鲈形目(Perciformes)、金枪鱼科(Thu-nnidae)，是一种生活在海洋中上层的洄游性鱼类，广泛分布于大西洋、印度洋、太平洋及地中海等温带及热带海域，为重要的海洋经济种类之一，具有生长快、产量高、营养丰富等优点[1]。目前，除鱼肉被制成生鱼片或罐头产品外，大量副产物尤其是高蛋白、低脂肪且富含氨基酸的鱼鳔通常被加工成低值的鱼粉和肥料，甚至被丢弃[2]。其综合价值不仅未得到充分开发与利用，还造成一定的资源浪费和环境污染。
近年来，酶解鱼类蛋白质制备活性肽的研究已成为提高鱼类附加值和开发生物活性物质的热门方向之一。酶解具有效率高、条件温和可控、无副反应、适用面广、酶用量少且来源广的特点，与酸碱降解相比具有无可比拟的优势[3]。针对金枪鱼类的酶解制备活性肽的研究，主要集中在鱼肉、骨和肠等方面[4-7]，而关于鲣鳔深加工的研究尚未见报道。因此，本研究以鲣鳔为实验材料，采用蛋白酶解手段，通过响应面优化工艺条件，制备具有较高DPPH自由基清除率的抗氧化酶解物，旨在为鲣鳔蛋白的高值化利用及其抗氧化肽的进一步研究和开发应用提供一定的科学依据。
1 材料与方法 1.1 实验材料鲣鳔，由宁波南联冷冻食品有限公司提供，于–20 °C冷藏；1,1-二苯基-2-苦基苯肼(DPPH)，购于TCI公司；菠萝蛋白酶(3×105 U/g)、复合蛋白酶(1.2×105 U/g)、碱性蛋白酶(2×105 U/g)、木瓜蛋白酶(8×105 U/g)、中性蛋白酶(1×105 U/g)购于上海源叶生物科技有限公司，胃蛋白酶(3×103 U/g)、胰蛋白酶(2.5×105 U/g)购于北京索莱宝科技有限公司。
1.2 实验方法鲣鳔酶解物的制备 取鲣鳔室温下解冻后剪成小碎片，于105 °C下干燥脱水至恒重后磨成粉，分别称取一定量的干鱼鳔，根据酶种类的不同，按料液比1∶10(W/V)依次加入相应pH的磷酸盐缓冲液，再加入一定量的酶，放入恒温水浴锅中，在各自适宜的温度下酶解一定时间，沸水浴灭酶10 min后，10 000 r/min离心10 min，取上清液过0.22 μm水系滤膜，收集滤液备用。
DPPH自由基清除率的测定 称取DPPH粉末10 mg，无水乙醇溶解并定容至50 mL，摇匀得到浓度为0.5 mmol/L的DPPH储备液，置于4 °C冰箱冷藏备用。使用前用乙醇将储备液浓度稀释至0.1 mmol/L。取3支试管，分别编号0、1和2，0号管加入1 mL DPPH溶液和1 mL无水乙醇，1号管加入1 mL DPPH溶液与1 mL酶解液，2号管加入1 mL无水乙醇和1 mL酶解液，分别充分混匀后静置，室温避光反应30 min后，利用DPPH的乙醇溶液呈紫红色且在波长517 nm处有最大吸收的特征，用酶标仪测定各样品在波长517 nm处的吸收值，分别标记为A0、A1和A2。DPPH自由基清除率的计算公式：
DPPH自由基清除率(%)=[1–(A1–A2)/A0]×100
每组样品重复3次，求得清除率的平均值。
蛋白酶的筛选 分别选择菠萝蛋白酶、复合蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶，并在各自最适的温度和溶液pH的条件[8-9]下对鲣鳔进行酶解，以酶解产物的DPPH自由基清除率为指标，筛选出最佳蛋白酶。
单因素实验 在选定最佳用酶的基础上，以DPPH自由基清除率为指标。单因素实验的基本条件为加酶量5.0 U/mg、初始pH 6.5、温度50 °C、酶解时间5 h，改变其中1个条件，保持其他条件不变，分别考察加酶量(1.2、3.0、5.0、8.0、10.0 U/mg)、初始pH (5.0、6.0、6.5、7.0、8.0)、酶解温度(40、45、50、55、60 °C)和酶解时间(3、4、5、6、7 h)等因素对鲣鳔酶解物DPPH自由基清除率的影响，每项实验设置3个平行，结果取平均值。
响应面优化实验 在单因素实验的基础上，以加酶量(A)、初始pH(B)、酶解温度(C)、酶解时间(D)4个因素为因子，酶解液的DPPH自由基清除能力为响应值，设计响应面实验。每组实验进行3次，结果取平均值。
酶解液的超滤分级 将响应面优化条件下制备的初酶解液，采用截留分子量分别为10 000和3000 u的超滤膜对其进行分级分离，分别收集超滤得到的3段组分：Ⅰ(>10 000 u)、Ⅱ(3000~10 000 u)、Ⅲ(<3000 u)，将各组分冷冻干燥后，测定各自不同浓度下的DPPH自由基清除活性。每组实验重复3次，结果取平均值。
2 结果与分析 2.1 不同蛋白酶对DPPH自由基清除率的影响7种不同蛋白酶的酶解物对DPPH自由基均具有不同程度的清除力，其中复合蛋白酶酶解物的DPPH清除率最高，为64.25%(图1)。这可能与不同蛋白酶具有不同的催化位点，导致形成肽的序列也有所不同有关[10]。因此，酶解鲣鳔制备抗氧化多肽的最佳用酶选定为复合蛋白酶。
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图 1 酶种类对鲣鳔酶解物DPPH自由基清除率的影响 1. 菠萝蛋白酶，2. 复合蛋白酶，3. 碱性蛋白酶，4. 木瓜蛋白酶，5. 胃蛋白酶，6. 胰蛋白酶，7. 中性蛋白酶 Fig. 1 Effect of enzyme type on DPPH radical scavenging rate of hydrolysates of K. pelamis swim bladder 1. bromelaine, 2. compound proteinase, 3. alkaline proteinase, 4. papain, 5. pepsin, 6. trypsin, 7. dispase |
在其他因素不变的条件下，改变加酶量，当加酶量为1.2 U/mg时，复合蛋白酶酶解物的DPPH自由基清除率为53.74%，随着加酶量的增加，DPPH自由基清除率也随之增大，在加酶量为8.0 U/mg时，酶解物的DPPH自由基清除率达到最高，为64.12%；但当继续增加加酶量时，DPPH自由基清除率却开始下降。这是因为起始阶段底物充足，加酶量越大，产生具有抗氧化活性的肽段就越多，当达到最高峰时，起始底物耗尽，这时再增加加酶量，使得具有活性的片段被降解为不具抗氧化活性的分子量更小的肽或单个氨基酸，从而使酶解物的DPPH自由基清除率降低(图2-a)。
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图 2 单因素实验结果 (a)加酶量对酶解物DPPH自由基清除率的影响；(b) pH对酶解物DPPH自由基清除率的影响；(c)酶解温度对酶解物DPPH自由基清除率的影响；(d)酶解时间对酶解物DPPH自由基清除率的影响 Fig. 2 Results of single-factor experiments (a) effect of enzyme dosage on DPPH radical scavenging rate of hydrolysates; (b) effect of pH on DPPH radical scavenging rate of hydrolysates; (c) effect of temperature on DPPH radical scavenging rate of hydrolysates; (d) effect of time on DPPH radical scavenging rate of hydrolysates |
在加酶量5.0 U/mg、温度50 °C、酶解时间5 h的条件下，改变初始pH大小。当初始溶液pH为5.0时，复合蛋白酶酶解物的DPPH自由基清除率仅为52.35%；pH值增加至6.0时，DPPH自由基清除率达到最高，为69.65%；随着pH继续增加，酶活性反而降低。这是由于酶活性与反应体系pH值密切相关，pH值的改变会影响酶分子的空间构象、与催化有关基团的解离状况、酶分子及底物的结合及酶–底物复合物的解离，进而影响酶活性[11]。由图2-b可见，此条件下的最适pH为6.0。
2.4 酶解温度对鲣鳔酶解物DPPH自由基清除率的影响其他因素不变，改变酶解温度。温度较低时，酶活性受到抑制，酶解温度设为40 °C时，复合蛋白酶酶解物的DPPH自由基清除率为52.41%，在一定的温度范围内，DPPH自由基清除率随着温度的增加而增大，温度为50 °C时，达到最大；但当温度超过一定范围，酶活性降低，DPPH自由基清除率也随之下降(图2-c)。
2.5 酶解时间对鲣鳔酶解物DPPH自由基清除率的影响其他因素不变，改变酶解时间。时间较短时，酶解不够充分，当酶解时间为3 h时，酶解物的DPPH自由基清除率仅为53.72%；随着酶解时间的延长，酶解物的DPPH自由基清除率也会随之增加，酶解时间5 h时，DPPH自由基清除率达到最大值，为64.64%；当酶解时间过长时，DPPH自由基清除率便会有所下降，这可能是由于原本具有DPPH自由基清除率的肽段被继续降解成无活性的片段所致(图2-d)。
2.6 响应面优化鲣鳔抗氧化酶解物的制备工艺方案及结果根据Box-Behnken设计原理[12]，设计四因素三水平实验(表1)，响应面实验(表2)总次数为29，其中中心点重复实验次数为5。采用Design Expert 8.0软件处理数据，进行回归方差分析(表3)。
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表 1 响应面实验设计因素及编码水平 Tab.1 Factors and code levels of response surface design |
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表 2 响应面实验设计与结果 Tab.2 Design and results of response surface |
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表 3 回归模型方差分析 Tab.3 Variance analysis of regression model |
通过对实验结果进行回归拟合，得到响应面回归模型方程：
DPPH自由基清除率=69.60+4.36 A–5.34 B+0.14 C+3.97 D+5.27AB+1.01 AC–3.55AD+0.44BC+5.47 BD–2.01 CD–3.14 A2–3.81 B2–2.07 C2–3.13 D2
根据二次回归方程各因素绝对值大小，可得到4个因素对DPPH自由基清除率的影响大小顺序：pH>加酶量>时间>温度。
方差分析可知，模型的F值为23.28、P>F<0.0001表明模型差异极显著，拟合效果较好；回归方程的一次项、交互项及二次项A、B、D、AB、AD、BD、A2、B2、C2和D2分别对DPPH自由基清除率影响显著(P<0.05)；失拟项P=0.9027>0.05、F=0.38表示相对于纯误差失拟项不显著，说明回归方程与实际值可较好拟合；R2=0.9588，表明模型的预测值与实际值高度相关；R2Adj=0.9176，说明可信度高；当信噪比大于4时，模型可信，实验测得信噪比为16.173，大于4，也说明模型可靠性强；变异系数(CV)为3.01%，说明实验的精确度高、实验模拟可信。因此，该回归方程能比较准确地分析和预测鱼鳔酶解物的抗氧化能力与加酶量、pH、温度和时间的关系，进而确定酶解的最佳条件。
2.7 响应面图分析及结果验证根据响应面实验结果和相应的回归方程，利用软件制作出响应面图(图3)。由图可知，响应值存在最佳值，经分析，鲣鳔抗氧化酶解物制备的最佳工艺条件：加酶量8.53 U/mg，pH 5.54，温度50.03 °C，时间5.07 h。响应面模型预测此条件下的DPPH自由基清除率为71.60%。为验证响应面模型的可靠性，采用上述工艺条件进行酶解实验，重复3次，得到DPPH自由基清除率的平均值为72.0%，与预测值间的相对误差较小，表明此响应面模型的拟合度高，能较为准确地预测并优化鲣鳔抗氧化酶解物制备工艺。
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图 3 各因素对鲣鳔酶解物DPPH自由基清除率的影响的响应面图 (a) 加酶量和pH对酶解物DPPH自由基清除率的影响响应面图；(b) 加酶量和温度对酶解物DPPH自由基清除率的影响响应面图；(c) 加酶量和时间对酶解物DPPH自由基清除率的影响响应面图；(d) pH和温度对酶解物DPPH自由基清除率的影响响应面；(e) pH和时间对酶解物DPPH自由基清除率的影响响应面图；(f) 温度和时间对酶解物DPPH自由基清除率的影响响应面 Fig. 3 Response surface plot of different factors on DPPH radical scavenging rate of hydrolysates of K. pelamis swim bladder (a) effect of enzyme dosage and pH on DPPH radical scavenging rate of hydrolysates; (b) effect of enzyme dosage and temperature on DPPH radical scavenging rate of hydrolysates; (c) effect of enzyme dosage and time on DPPH radical scavenging rate of hydrolysates; (d) effect of pH and temperature on DPPH radical scavenging rate of hydrolysates; (e) effect of pH and time on DPPH radical scavenging rate of hydrolysates; (f) effect of temperature and time on DPPH radical scavenging rate of hydrolysates |
测定组分Ⅰ(>10 000 u)、Ⅱ(3000~10 000 u)、Ⅲ(<3000 u)分别在不同浓度下的DPPH自由基清除率(图4)。一定范围内，随着浓度的增加，各组分的DPPH自由基清除率也基本呈增强趋势；相同浓度下，3段组分相比，组分Ⅲ(<3000 u)的DPPH自由基清除活性最强；在浓度小于0.5 mg/mL的范围内，组分Ⅰ(>10 000 u)和Ⅱ(3000~10 000 u)在相同浓度下的DPPH自由基清除率基本一致，而在浓度大于0.5 mg/mL时，相同浓度下组分Ⅱ的DPPH自由基清除率大于组分Ⅰ；经计算，组分Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的IC50分别为0.64、0.52和0.37 mg/mL。
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图 4 不同浓度下鲣鳔各级酶解组分的DPPH自由基清除率 Fig. 4 DPPH radical scavenging rate of hydrolysis fractions of K. pelamis swim bladder with different molecular weight |
本研究首次以鲣鳔为实验材料，采用酶解技术制备抗氧化多肽，通过单因素实验和响应面法对抗氧化酶解物的制备工艺进行优化，从而得到鲣鳔蛋白抗氧化酶解物制备的最佳工艺条件：复合蛋白酶加酶量8.53 U/mg，pH 5.54，温度50.03 °C，时间5.07 h，此条件下的DPPH自由基清除率为71.60%。段振华等[13]采用复合蛋白酶对海南当地市场的干鱼鳔制品进行酶解，酶解条件的单因素探究结果为pH 5.0~7.0、温度50~60 °C和时间5~6 h，本研究在pH、温度和时间方面的优化结果符合段振华等[13]研究的条件范围；在工艺优化手段上，本实验采用的响应面优化法更能直观地反映各因素间的相互作用及多个因素对响应值影响的函数关系，从而高效而准确地确定最优条件[14]。常虹等[15]又对酶解海南干鱼鳔蛋白制备抗氧化肽的最佳条件进行探索，以酶解产物清除DPPH自由基的能力为指标，从胰蛋白酶、中性蛋白酶和风味蛋白酶3种酶中确定胰蛋白酶为最佳酶制剂，并采用单因素和响应面实验优化出最佳酶解条件，制备出对DPPH自由基清除力高达76.06%的鱼鳔抗氧化肽。与上述研究相比，本研究蛋白酶选择的范围更广，对最适蛋白酶的确定更为精准。本研究在最优条件下制备得到的抗氧化酶解物对DPPH自由基清除率(71.60%)稍低于常虹等[15]的研究结果(76.06%)，这种差异可能主要是由于蛋白酶和酶解底物的不同造成的，不同酶的酶切位点和酶解底物的氨基酸序列的不同使获得的酶解产物抗氧化肽的种类和含量存在差异[16]。基于王佳莉[17]关于蛋白酶水解金枪鱼副产物的工艺研究说明双酶联合酶解效果优于单酶酶解，能提高底物水解率，这为鲣鳔的进一步加工利用提供研究思路，将来可考虑采用双酶酶解鲣鳔，探究联合作用的酶的选择及双酶作用的酶解条件等对水解度和抗氧化能力的影响。
随着活性肽的逐步深入研究与应用，现有大量研究[18-20]表明，许多海洋鱼类活性肽具有抗氧化活性，可以作为潜在的药物、保健品和食品防腐剂[3，21]。柯虹乔[11]研究大眼金枪鱼(Thunnus obesus)鱼头蛋白酶解物超滤后的各组分的抗氧化活性，其中组分(<1000 u)的活性最好，对DPPH自由基的IC50值为0.93 mg/mL；谭洪亮等[22]从鲣鱼骨中制备出抗氧化的胶原十肽，分子质量为839.87 u，其氨基酸序列为Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Ala-Gly-Glu-Gln-Gly，对DPPH自由基的IC50值为0.97 mg/mL，且氨基酸组成分析发现其富含Glu、Lys和Leu；Chi等[23]对鲣暗色肉中性蛋白酶酶解物和碱性蛋白酶酶解物分别超滤得到的小于3000 u组分对DPPH自由基的IC50值分别为3.09和2.21 mg/mL，二者均富含Glu、Leu和Asp等氨基酸。本研究通过超滤鲣鳔初酶解产物，得到的组分Ⅲ(<3000 u) 对DPPH自由基的清除活性 (IC50=0.37 mg/mL)均高于上述研究结果，但低于Wang等[24]应用一系列连续分离技术从日本鲐(Pneum-atophorus japonicus)水解液中纯化出的分子质量为1664 u的抗氧化肽(IC50=0.2335 mg/mL)，这说明鲣鳔酶解物中小于3000 u的组分具有较强的抗氧化活性，但若要得到活性更高的抗氧化产物，还需通过柱层析等方法对其进一步分离纯化，得到单个活性肽并进行多肽序列鉴定，以探明多肽发挥抗氧化作用与其分子量大小、氨基酸残基种类和特定氨基酸序列等因素的关系及其实际应用的安全性和有效性。
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