光裸方格星虫(Sipunculus nudus)属方格星虫目(Sipunculiformes)，方格星虫科(Sipunculidae)，方格星虫属(Sipunculus)，为世界性暖水种^[1]。主要分布于我国东南沿海及北部湾沿海，尤其以广西沿海资源最为丰富^[2]，因喜栖于泥沙质或砂质海滩，俗称“沙虫”。在欧洲，人们通常用其作为鱼饵；在中国和越南，因其极佳的鲜味和营养价值而备受青睐^[3]。光裸方格星虫经济价值高，滩涂人工增养殖市场前景诱人，已然成为北部湾滩涂养殖新热点。由于多年来的过度滥采挖、填海造地、新建沿海工业、码头等，光裸方格星虫的优质种质资源日益衰竭，因此，光裸方格星虫的遗传多样性研究以及保育等工作迫在眉睫。

线粒体DNA (mtDNA)因分子量小^[4]、高突变率和严格母性遗传^[5-6]而被广泛应用到分子遗传学研究中。其控制区是线粒体基因组中重要的非编码区^[7]，具有较高的核苷酸替换率和核苷酸插入、缺失等突变率，是整个mtDNA基因组序列和长度变异最大的区域，进化速率是其他序列的5~l0倍，在近缘种群或同一群体不同个体间具有显著的差异，特别适合种群遗传多样性分析^[8-11]。

目前，国内外对于光裸方格星虫遗传多样性的研究^[12-17]已有报道，但对光裸方格星虫资源丰富的广西沿海取样点少，尚未有基于mtDNA控制区序列的光裸方格星虫群体遗传结构分析，本研究基于光裸方格星虫群体mtDNA控制区序列，探讨北部湾6个不同光裸方格星虫地理群体的遗传结构，为其资源状况和保育等工作提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 实验材料

实验所用光裸方格星虫于2010年10月至2015年5月，分别采自中国湛江(ZJ)、防城港(FC)、钦州(QZ)、北海大冠沙(BH)、儋州(DZ)和越南海防(YN)的6个自然群体(表1)。样本活体运回实验室，取体壁肌肉于95%酒精中固定，–20 °C保存备用。

1.2 DNA的提取与PCR的扩增

剪取30 mg组织，采用TIANamp Marine Animals DNA Kit(北京天根)海洋动物组织基因组DNA试剂盒进行基因组DNA提取，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，4 °C保存备用。

从GenBank数据库下载光裸方格星虫线粒体基因组全长序列(S. nudus，FJ422961.1；KJ754934.1)，同源比对这两个序列的控制区及其上下游序列，设计控制区扩增简并引物：D-Loop142上：5′-CACGSCTCCCATTTTCYCTCCGATT-3′；D-Loop1180下：5′-CCTGYKGTGCGKGTTATTAARACAAG-3′。引物由南宁市天地杨生物科技有限公司合成。PCR反应体系为25 μL，包含2.5 μL 10× PCR Buffer、2 μL MgCl₂ (25 mmol/L)、1 μL dNTPs (10 mmol/L)、0.2 μL Taq聚合酶(2.5 U/μL)、上下游引物(10 μmol/L)各1 μL、DNA模板1.5 μL，补充无菌水至25 μL。所用试剂均购自天根生化科技(北京)有限公司。PCR反应程序：94 °C 预变性5 min；94 °C变性50 s、55 °C退火40 s、72 °C延伸60 s，共运行32个循环；72 °C终延伸10 min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后，送至上海立菲生物技术有限公司双向测序和拼接。

1.3 数据分析

对所有拼接所得样品序列用DNASTAR和MEGA 6.0 (molecular evolutionary genetics analysis)软件进行比对，并辅以人工校正，确定序列比对长度；然后用该软件^[18]分析各群体以及群体间的核苷酸组成，基于单倍型构建NJ (Neighbor Joining)系统聚类树。利用DnaSP 5.0^[19]分析各个群体的遗传多样性水平。使用Network 4.6^[20]软件构建单倍型的简约中介(Reduced-Median, MJ)网络图。运用Arlequin 3.5^[21]软件进行分子差异分析(AMOVA)，计算分遗传分化系数F_st (F-statistics)，按照Wright的F_st法计算反映基因流强度的类群每代迁移数：N_m=1–F_st/4F_st^[22]。

结合中性检验和核苷酸不配对分布(mismatch distribution analysis)来进行群体动态分析，利用群体扩增参数τ，由公式τ=2ut估算群体扩张时间^[21]，其中u是整个序列的突变率(%)(u=μk，k为序列大小、μ为控制区进化速率)，t表示扩张发生至今的时间。

2 结果 2.1 序列特征及群体遗传多样性

实验所得测序和拼接成功的光裸方格星虫mtDNA控制区序列共93条，长度1030 bp，包含控制区上游和下游部分序列。将所得的93条序列与国内方格星虫线粒体基因组全序列(GenBank: KJ754934.1)同源比对，并手工校正，最终得到用于比对分析序列的平均长度为468 bp。使用MEGA 6.0 软件分析所有群体的核苷酸组成，结果显示各群体的碱基含量基本一致，且所有群体的A+T (73.06%)的含量均显著高于G+C (26.94%)。

分析6个不同地理群体的光裸方格星虫，共检测到107个变异位点(表2)。共定义了85个单倍型，其中共享单倍型有6个(Hap9、Hap20、Hap33、Hap36、Hap48、Hap66)，每个群体都有各自独享的单倍型。表2为6个光裸方格星虫群体的遗传多样性参数，结果显示，总体的单倍体多样性(H_d)、核苷酸多样性(P_i)和平均核苷酸差异数(K)分别为0.998、0.018 89和8.4836。其中越南、北海、防城港、湛江群体H_d最高，均为1.000，最低为钦州群体(0.9820)；从P_i和K来看，其最高值均出现在儋州群体(P_i：0.025 02、K：11.5088)，最低值均出现在钦州群体(P_i：0.015 07、K：6.9636)。

2.2 群体遗传距离和单倍型NJ聚类分析

基于Kimura双参数模型(Kimura 2-parameter)计算6个群体内与群体间的平均遗传距离(表3)，各群体内的平均遗传距离最大值为儋州群体(0.024)，最小值为钦州群体(0.015)，6个群体的群体内平均遗传距离大小为DZ>ZJ>FC>YN>BH>QZ。6个光裸方格星虫群体间的遗传距离(0.016~0.022)差异不大，其中以儋州与防城港和湛江的值最大(0.022)，钦州与越南、北海的值最小(0.016)。

基于85个单倍型来构建系统NJ树，6个光裸方格星虫群体无明显分支(图1)。

2.3 群体遗传结构

对6个光裸方格星虫群体两两之间的F_st值分析结果如表4所示，各群体之间的F_st值为–0.018 13~0.028 05，统计检验均不显著(P>0.05)，显示群体间分化较小。基因流结果表明群体间存在明显的基因交流，防城港与钦州群体基因交流最大(162.09)，与湛江群体基因交流最小(8.66)。

根据AMOVA分析(表5)可知6个群体间的遗传分化指数F_st为0.002 60(P>0.05)。光裸方格星虫的遗传差异主要来自群体内(99.74%)，群体间的差异则比较小(0.26%)。由单倍型中介网络图可知，各地理群体的单倍型并没有明显的分支(图2，圆圈大小表示单倍型的频率，圆圈面积与单倍型频率成正比)。

2.4 群体动态分析

因各地理群体间的遗传分化程度较低，所以将6个地理群体作为一个整体进行群体动态分析。由中性检验可知Tajima’s D和Fu’s Fs值均为负值且差异显著(表6)。群体核苷酸不配对分布图呈明显的单峰分布(图3)。综合中性检验与核苷酸不配对分布可推测出光裸方格星虫群体在历史上曾出现群体扩张。

参考Kawauchi等^[23]研究显示星虫动物门(Sipuncula)的COI序列进化率为0.3%/百万年，COI是线粒体基因中进化速率最慢的^[24]，而控制区却是最快的，且其进化速率约为线粒体其他区段序列的2~5倍^[25]，由此可估算出本研究中控制区的突变率u约为7.02/百万年。结合表6的τ (95%Cl) 值，代时取2(光裸方格星虫通常在2龄达到性成熟)，根据公式τ=2ut可推算群体扩张时间约为距今171万年前(1.7197百万年)。

3 讨论 3.1 单倍体多样性和核苷酸多样性

基于线粒体控制区的分析是研究种群遗传多样性和遗传变异的有效手段之一。本研究对光裸方格星虫线粒体控制区碱基组成进行分析，发现其富含AT。Mwinyi等^[13]在对光裸方格星虫线粒体基因的研究中提出，光裸方格星虫的mtDNA与大多数后生动物一样，为共价闭合环状双分子双链DNA(约155 502 bp)，非编码区高度富集AT，本研究结果与其相符，这一结果也与其他无脊椎动物控制区序列的研究一致^[26-27]。

单倍型多样性(H_d)和核苷酸多样性(P_i)是衡量遗传多样性的重要指标。本实验所得总群体的单倍型多样性(H_d)和核苷酸多样性(P_i)分别为0.998和0.018 89。Du等^[17]利用COI研究北海、厦门和三亚等地方格星虫遗传多样性，得出其平均H_d和P_i分别为0.9754和0.0035。本研究结论较其他海水动物线粒体基因同区段的研究而言，高于乌鳢^[10](Ophiocephalus argus) (H_d：0.875；P_i：0.003 27)和鰖(Therapon theraps) (H_d：0.986；P_i：0.009)^[28]，稍高于中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis) (H_d：0.958；P_i：0.017)^[29]，低于仿刺参(Apostichopus japonicus) (H_d：0.975；P_i：0.037 67)^[29]。物种具有适应种群快速增长的生活史且个体数目较多，可能是其具有较高的单倍型多样性和核苷酸多样性的原因^[30-32]。群体内的遗传距离表示了群体内个体间的遗传差异，亦可作为评价该群体遗传多样性的指标^[33]。根据遗传多样性参数(核苷酸多样性和平均核苷酸差异数)和群体内遗传距离，各群体遗传多样性大小为DZ>ZJ>FC>YN>BH>QZ。

本研究显示，目前光裸方格星虫群体的遗传多样性仍处于较高水平，这与许多学者研究结果相类似。以往学者对光裸方格星虫遗传多样性的研究一致认为光裸方格星虫群体有着较高水平的遗传多样性^[14-17]。而郭昱嵩等^[12]的研究则认为光裸方格星虫群体的遗传多样性水平处于中等程度。上述研究结果表明，目前北部湾沿海光裸方格星虫种质资源仍处于良好状况。

3.2 群体变异和动态分析

本研究中，各群体间的遗传距离差异不大，且群体间的遗传分化程度较小。本研究中各群体之间的遗传分化系数F_st值为–0.018 13~0.028 05 (P>0.05)，遗传分化不明显。各群体间存在较频繁的基因交流(N_m为8.66~162.09)。AMOVA分析佐证，遗传差异主要来自群体内(99.74%)，群体间的差异则比较小(0.26%)。单倍型NJ聚类可知，6个光裸方格星虫地理群体无明显地理聚类分支。综合单倍型中介网络图显示无明显的谱系分支、群体间变异和遗传分化极小等结果，本研究支持将北部湾光裸方格星虫归为一个管理单元。

物种的生物学特性^[34]和进化史^[35]对其种群的遗传结构也有一定的影响。海洋动物浮游幼体的扩散为群体间基因交流提供了时机，种群扩散和基因交流还受海洋物理因素如海流、温度和季风等影响^[37-38]。光裸方格星虫浮游幼体时期长(水温21.5~34.0 °C以下为7.5~27 d) ^[39]，其海球幼体时期有长期漂浮于海水中的生存能力，可以令其广泛分布^[17]。其他无脊椎动物中，也存在由于其浮游幼虫阶段的生活史引起群体间频繁基因交流的现象，如美洲巨牡蛎(Crassostrea virginica)^[39]、栉孔扇贝(Chlamys farrei)^[40]等。本研究中，群体遗传分化的结论与其他学者对光裸方格星虫遗传分化的研究结果^[14-17]迥异，这可能因采集地、采集时间点和检测所用分子标记方法等因素的不同所导致。如Du等^[17]利用线粒体基因CO I分析北海、三亚和厦门3地光裸方格星虫遗传结构得出群体间分化明显，与本研究结果有差别。而郭昱嵩等^[12]利用SSR标记研究广东湛江、广西北海及越南锦普3个光裸方格星虫地理群体遗传多样性，发现其杂合度均偏低，群体间存在较大的基因流，群体间已产生遗传分化，但分化水平还较低，与本研究结果相类似。本研究中，单倍型中介网络图显示无明显的谱系分支，其原因可能是北部湾湾内不存在明显阻碍种群扩散的地理屏障。此外，近年来北部湾区域光裸方格星虫的苗种相互售卖至各地，进行滩涂底播养殖现象日渐增加，这也很可能引起该区域群体间频繁的基因交流^[12，41]。

群体动态分析推测，光裸方格星虫经历过群体扩张事件^[42]，估算光裸方格星虫种群扩张时间约为171万年前，处于早更新世^[43]。早更新世距今约为0.73~2.43百万年，伴随着强烈的全球气候变化，早更新世是全球气候和环境变化的一个重要时期，当时气候周期转型，全球冰量增加，海平面下降，剧烈的环境变化对物种形成、地理分布和遗传变化有着深远的意义^[44-45]。

3.3 多样性保护与可持续利用

本研究基于mtDNA控制区序列分析，研究结果显示光裸方格星虫目前仍具有较高水平的遗传多样性，具有进一步进行保育选育的潜能。但由于当前人工非法采挖过度，尤其是无序、大范围的使用高压水枪采挖贝类和光裸方格星虫，对光裸方格星虫滩涂资源造成巨大破坏，同时导致光裸方格星虫幼体和成体的死亡。因此需要加大光裸方格星虫资源保护力度，科学规范地划分天然保育区加以保护，实时监测种质资源状况。本研究中显示6个群体间遗传分化很小，可能因其浮游幼体期的分散能力，或是近几年人工增养殖进行的各地苗种侵入等因素造成种质混杂，加剧了群体间的基因交流。种质混杂容易造成对其遗传背景的模糊和不确定性，因此需要对外来苗种圈定养殖区域并进行科学评估，防止光裸方格星虫优质资源退化和优良性状的丢失，使其种质得到保护，使资源得以可持续利用。