皮氏叫姑鱼(Johnius belangerii)属暖水性近海底层鱼类，隶属于硬骨鱼亚纲(Osteichthyes)、鲈形目(Perciformes)、石首鱼科(Sciaenidae)、叫姑鱼属(Jounius)，主要分布于印度—西太平洋海区，在中国沿海、韩国及日本诸海均有分布^[1]。皮氏叫姑鱼是马鞍列岛海域渔业资源的重要组成种类，主要摄食小型底栖鱼类、虾类等，同时也是鳓(Ilisha elogata)、龙头鱼(Harpadon nehereus)、海鳗(Muraenesox cinereus)、大黄鱼(Larimichthys crocea)、带鱼(Trichiutus lepturus)、蓝点马鲛(Scomberomorus niphonius)、牙鲆(Paralichthy solivaceus)等重要的饵料生物^[2]，属于东海北部海域重要的底栖、游泳动物食性功能种团^[3]，在食物网中具有重要地位。

国内对皮氏叫姑鱼的研究主要是在渔业生物学方面，唐启升^[4]对我国黄渤海、东海和南海北部的叫姑鱼生物学特性和资源量等进行了分析与评估，王凯等^[2]对马鞍列岛的皮氏叫姑鱼体长组成、体长与体质量关系、性比、繁殖习性和摄食等方面进行了较详细的研究，并将其饵料生物分为鱼类、虾类、蟹类、端足类等，共计41种饵料生物，但仍有大量由于消化程度较高而无法鉴定的食物组成。

在传统的食性分析中普遍采用形态学观察法^[5]，而对肉眼不可辨认组分的鉴定一直是食性分析中被忽视的环节；随着DNA条形码技术的兴起^[6-11]，不少国外学者利用该技术进行食性分析。例如，Barnett等^[12]对扁头哈那鲨(Notorychus cepedianus)的胃含物进行了基因分析，通过洗胃来收集胃含物样品，既保护了研究对象，又对其食性进行了较准确的了解。Budarf等^[13]利用DNA条形码和形态学观察相结合的方法，对部分海洋植食性鱼类胃含物进行了精确鉴定，并认为该方法比形态学鉴定更加有效。在国内，仅有少数研究人员应用分子生物学手段鉴定胃含物中的不可辨认组分。洪巧巧^[14]在研究长江口花鲈(Latelabrax japonicus)食性时，对结合分子生物学(16S rDNA序列)和形态学观察的可行性以及两种方法的比较进行了探讨，并认为两种方法的结合将得出更加准确的食性分析结果。本实验选择马鞍列岛海域为研究区域，采用DNA条形码技术对皮氏叫姑鱼夏季胃含物中不可辨认的食物组分进行种类鉴定，通过分析夏季皮氏叫姑鱼的食物基础，为保护皮氏叫姑鱼资源提供合理化建议。

采样区域位于浙江舟山马鞍列岛(E：122°35′~122°51′；N：30°41′~30°52′)海域，根据马鞍列岛海域的地形和皮氏叫姑鱼的生活习性，选用多网目组合刺网捕捉皮氏叫姑鱼，网目尺寸范围为25~80 mm。具体方法参考汪振华等^[15]的方法，采样时间2014年8月，每次放置时间约为24 h。将捕获对象放置保温箱冷藏保存，带回实验室分析。

对捕获的皮氏叫姑鱼进行生物学测量，各项测量指标严格按照《海洋调查规范》(GB12763.6-2007)第六部分《海洋生物调查》^[16]进行，主要包括体长、体质量、纯重、摄食等级和胃含物分析等。胃含物分析时采用精度为0.001 g的电子秤，解剖观察并记录摄食等级，对形态学观察无法识别的种类进行编号留样，使用已灭菌的PE管将其保存于95%的乙醇中，置于4 °C的冰箱中保存。为防止不同样品之间的DNA交叉污染，采集过程中的所用剪刀、镊子等事先进行严格清洗。

采用美国Axygen动植物基因组DNA提取试剂盒提取胃含物样品基因组DNA，使用NanoDrop 2000超微量分光光度计测定DNA浓度。选取线粒体基因细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ (mitochondrial cytochrome oxidase subunit Ⅰ, COⅠ)作为分子标记，对组织DNA进行50 μL体系(2×TaqPCRMaster Mix 25 μL，引物F/R各1 μL，DNA1 μL，ddH₂O 22 μL)PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应)扩增，在1%的琼脂糖凝胶(含EB)电泳之后进行胶回收(TIANGEN gel extraction kit)，本次实验针对不同的胃含物种类采用不同的引物(表1)，分别为鱼类、无脊椎动物的通用引物，所采用的PCR的反应条件为94 °C预变性1 min，94 °C变性30s，55 °C/40 °C退火30s，72 °C延伸40 s，35个循环，最后72 °C延伸10 min。

表 1(Tab.1)

表 1 皮氏叫姑鱼胃含物种类鉴定的PCR引物 Tab.1 PCR primers for species identification in J. belangerii gut content 目标种类species 通用引物universal primer 序列(5′–3′)sequence 退火温度/°Cannealing temperature 产物大小/bpsize 参考文献reference 鱼类fish FF2d TTCTCCACCAACCACAARGAYATYGG 55 681 [17] FR1d CACCTCAGGGTGTCCGAARAAYCARAA 无脊椎动物invertebrate LC01490 GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG 40 710 [18] HC02198 TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA

表 1 皮氏叫姑鱼胃含物种类鉴定的PCR引物 Tab.1 PCR primers for species identification in J. belangerii gut content

电泳后出现单一条带的PCR产物，在紫外灯下用已灭菌的医用手术刀切下目的片段，使用TIANGEN琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的片段，将其连接至PGEM-T载体后，转化到DH5α大肠杆菌感受态细胞中，经蓝白斑筛选后，挑选5~6个单克隆培养，进行PCR扩增M₁₃检测(10 μL体系：2×TaqPCRMaster Mix 5 μL，M₁₃ R/F 0.5 μL+0.5 μL，菌液 0.5 μL，ddH₂O 3.5 μL)，挑选在700 bp有条带显示的样品，送生工生物工程(上海)有限公司(Sangon biotech)测序。

通过GenBank中的BLAST，结合序列相似性和系统进化关系，对所测得的序列进行逐个比对分析并下载数据库中相似性最高的序列片段，在CLASTAL X中进行序列比对分析，利用MEGA 6.0构建Neighbour-Joining(NJ)系统进化树并确定物种。

根据胃含物分析结果，分别计算出饵料生物的出现频率(F%)；利用出现频率比较形态学观察与分子鉴定法所得到的食物种类。

本次调查共捕获皮氏叫姑鱼201尾，通过解剖发现夏季皮氏叫姑鱼的空胃率较高，达到84.65%，共获得30个有效的胃含物样本，通过形态学鉴定出的胃含物种类为口虾蛄(Oratosquilla oratoria)、日本鼓虾(Alpheus japonicus)、沙蚕(Nereis succinea)、日本蟳(Charybdis japonica)幼体。

比对序列测定结果，共得到相似性>97%的序列18条，利用系统进化关系(图1)分析出在不可辨认的食物糜中，存在6种虾类，3种鱼类，1种蟹类，包括中华管鞭虾、鲜明鼓虾、巨指长臂虾、葛氏长臂虾、日本鼓虾、中国毛虾、日本鳀、皮氏叫姑鱼、褐菖鲉、红星梭子蟹。其中，在4个样本(样品序号为0-1、54-1、55-2、73-1)中均扩增出了皮氏叫姑鱼的COⅠ序列；而在进化树中无法直接确定的样本(73-2、74、80)则根据GenBank中相似度>97%序列，鉴定为皮氏叫姑鱼(样品序号73-2、80)、鲜明鼓虾(样品序号74)。

通过比较形态学鉴定和COⅠ鉴定结果(表2)，可以从每个不可辨认的食物组分中至少鉴定出一个物种。

表 2(Tab.2)

表 2 形态学观察与DNA鉴定结果 Tab.2 The result of morphological observation and DNA identification 编号number 样品序号sample no. 形态学鉴定visual identification 不可辨认部分的COⅠ鉴定COⅠ identification of unidentified stomach content 1 71 糜*　chyme 中华管鞭虾　 S. crassicornis 2 72 日本鼓虾　 A. japonicus、糜*　chyme 日本鼓虾　 A. japonicus 3 65 沙蚕　 Nereis succinea、糜*　chyme 日本鳀　 E. japonius 4 54-1、54-2 口虾蛄　 O. oratoria、沙蚕　 N. succinea、糜*　chyme 葛氏长臂虾　 P. gravieri、皮氏叫姑鱼　 J. belangerii 5 49 不可辨虾　undistinguished shrimp 鲜明鼓虾　 A. distinguendus 6 55-1、55-2 不可辨蟹　undistinguished crab 红星梭子蟹　 P. sanguinolentus、皮氏叫姑鱼　 J. belangerii 7 69-1、69-2 糜*chyme 巨指长臂虾　 P. macrodactylus、葛氏长臂虾　 P. gravieri 8 86 不可辨虾　undistinguished shrimp 日本鼓虾　 A. japonicus 9 1 糜*　chyme 褐菖鲉　 S. marmoratus 10 0-1、0-2 不可辨虾　undistinguished shrimp 中国毛虾　 A. chinensis、皮氏叫姑鱼　 J. belangerii 11 73-1、73-2 糜*　chyme 皮氏叫姑鱼　 J. belangerii、皮氏叫姑鱼　 J. belangerii 12 80 糜*　chyme 皮氏叫姑鱼　 J. belangerii 13 74 糜*　chyme 鲜明鼓虾　 A. distinguendus 注：糜*是指胃含物中无法通过肉眼及显微镜观察鉴定的食物残余物，一般是饵料生物的肌肉组织、未消化完全的甲壳类的壳，或已经消化完全呈现流体状的食物残渣Notes: *chyme is undigested stomach content, usually including muscle tissue and crust of undistinguished shrimp and crab, even food mass shaped like fluid

表 2 形态学观察与DNA鉴定结果 Tab.2 The result of morphological observation and DNA identification

根据2009年5月至10月(未公开数据)及2014年8月的调查结果，皮氏叫姑鱼主要以虾蟹类为食，其中葛氏长臂虾、中华管鞭虾、口虾蛄是马鞍列岛夏季优势种类，日本鼓虾、鲜明鼓虾属于该海域常见种，日本蟳、双斑蟳(C. bimaculata)是该海域的优势蟹类，隆线强蟹(Eucrate crenata)、红星梭子蟹属于常见种，据此推测皮氏叫姑鱼在马鞍列岛海域的摄食种类主要是当地一些优势种、常见种，也有其他小型虾蟹类、幼鱼等。与往年只通过形态学鉴定得到的数据相比(表3)，利用条形码技术可以在有限的实验样品中获得更多的种类信息；选取2009年每航次捕获尾数超过30尾的鱼类胃含物数据(2009年5月—2009年10月)，发现其食物组成共有19种(表3)，而2014年8月结合形态学观察与DNA条形码鉴定(其中形态学鉴定出4种)，共得到食物种类12种，说明结合两种方法可以在有限样品的情况下补充更多反映客观事实的信息；此外，对于样品的充分利用，有助于降低资源调查活动对渔业资源存在现状的干扰程度，减轻调查活动对岛礁海域自然生态系统的破坏，更加符合资源可持续利用的宗旨。

表 3(Tab.3)

表 3 本实验与2009年数据中皮氏叫姑鱼的食物种类组成的比较 Tab.3 Comparison about species in J. belangerii diet between this case’s and 2009’s data 名称name 采集时间　sampling time 200905 200906 200907 200908 200909 200910 201408 201408* 鱼类　fish 褐菖鲉　 S. marmoratus + + + 六丝矛尾虾虎鱼　 Chaeturichthys hexanema + + + + + 日本鳀　 Engraulis japonius + + + + 皮氏叫姑鱼　 J. belangerii + 虾类　shrimps 葛氏长臂虾　 P. gravieri + 日本鼓虾　 A. japonicus + + + 细巧仿对虾　 P. tenella + 鲜明鼓虾　 A. distinguendus + + + + + + 中国毛虾　 A. chinensis + + + 中华管鞭虾　 S. crassicornis + 巨指长臂虾　 P. macrodactylus + 口虾蛄　 O. oratoria + 蟹类　crabs 隆线强蟹　 E. crenata + + 强壮棱蟹　 Parthenope validus + 日本蟳　 C. japonica + + + + 日本岩瓷蟹　 Petrolisthes japonicus + 锐齿蟳　 C. acuta + 红星梭子蟹　 P. sanguinolentus + 双斑蟳　 C. bimaculata + 端足类　Amphipoda 麦秆虫　Caprellidea + + + + 钩虾　Gammarid + 其他类　others 短蛸　 O. ocellatus + 滩栖阳澻足　 Amphiura vadicola + 沙蚕　 N. succinea + + 总计　total 4 6 9 5 5 7 4 10 注：201408的调查结果分为形态学结果与分子鉴定结果，201408表示采用形态学鉴定，201408*表示采用COⅠ鉴定，2009年的皮氏叫姑鱼胃含物数据均采用形态学鉴定。表中的每批样本数均大于等于30Notes: The diet results from August 2014 (201408) are divided into two parts according to the identification method, i.e. morphology and DNA barcoding. 201408 indicates morphological identification results and 201408*shows DNA barcoding results. Diet results for J. belangerii in 2009 were obtained by visual identification in the same investigating area. Every sample number in this table was ≥30

表 3 本实验与2009年数据中皮氏叫姑鱼的食物种类组成的比较 Tab.3 Comparison about species in J. belangerii diet between this case’s and 2009’s data

图 1(Fig. 1)

图 1 马鞍列岛海域水生生物与皮氏叫姑鱼胃含物COⅠ系统发育树 Fig. 1 Phylogenetic tree about COⅠ of aquatic organism and stomach contents of J. belangerii in Ma’an Archipelago

相比于只采用一种鉴定方法，两种方法的结合能够提供更多的种类信息。从物种的出现频率(表4)中得出，皮氏叫姑鱼主要摄食虾蟹类、少数鱼类以及部分底栖生物；而对比王凯等^[2]的研究结果，本实验中发现日本鳀、中华管鞭虾、巨指长臂虾、鲜明鼓虾、中国毛虾、葛氏长臂虾、口虾蛄、沙蚕均在8月的摄食对象中出现；而对比2009年的形态鉴定结果，两种方法的结合可以覆盖到2009年鉴定种类的63.16%，并发现此前未鉴定出的中华管鞭虾、巨指长臂虾、口虾蛄、红星梭子蟹。

表 4(Tab.4)

表 4 形态学鉴定与分子鉴定的物种出现频率 Tab.4 Frequency of species occurrence in morphological and molecular identification 种类species 出现次数times 出现频率frequency 鉴定方法methods 鱼类fish 日本鳀E. japonius 1 0.036 COⅠ 褐菖鲉S. marmoratus 1 0.036 COⅠ 皮氏叫姑鱼J. belangerii 6 0.214 COⅠ 虾类shrimps 中华管鞭虾S. crassicornis 1 0.036 COⅠ 鲜明鼓虾A. distinguendus 2 0.071 COⅠ 巨指长臂虾P. macrodactylus 1 0.036 COⅠ 葛氏长臂虾P. gravieri 2 0.071 COⅠ 中国毛虾A. chinensis 1 0.036 形态鉴定morphological 日本鼓虾A. japonicus 4 0.143 COⅠ和形态鉴定COⅠ, morphological 口虾蛄O. oratoria 1 0.036 形态鉴定morphological 蟹类crabs 红星梭子蟹P. sanguinolentus 1 0.036 COⅠ 日本蟳C. japonica 5 0.178 形态鉴定morphological 其他类others 沙蚕N. succinea 2 0.071 形态鉴定morphological 合计total 28 1.000 注：此表格中的数据来自于2014年8月调查中的所有可鉴定样品Notes: Data in this table is from identified samples in August 2014

表 4 形态学鉴定与分子鉴定的物种出现频率 Tab.4 Frequency of species occurrence in morphological and molecular identification

本实验中利用鱼类通用引物和无脊椎动物通用引物对不可辨认食物组成进行COⅠ序列扩增，虽可以不受鉴定对象的限制，扩增出食物糜中的序列信息，辅助进行更精确的食性分析，需要事先建立一个比较完整的数据库，才能满足后期比对分析的要求。除此之外，DNA条形码只能满足定性鉴定的要求，不能达到定量分析的目的。因此，还需要结合形态学观察进行定量分析，才能得到较完整的食性分析结果。

此外，皮氏叫姑鱼多次出现在COⅠ鉴定结果中，但仅通过DNA分析结果无法判断是否存在自食现象，借鉴王凯等^[2]对马鞍列岛海域皮氏叫姑鱼食物组成的研究结果，未发现存在自食现象；此外，在现场采样解剖胃含物的过程中没有发现皮氏叫姑鱼，据此推测实验过程中可能存在基因污染或自身DNA干扰^[19-20]。

本研究结果显示出许多以往调查未发现的种类，如巨指长臂虾、中华管鞭虾、红星梭子蟹等，这些种类分布于泥地生境、泥沙石生境，在该海域并不占数量上的优势，在调查中可捕获的概率较小，因此本研究获得的摄食种类更加多样化，并以虾类为主^[21]；另外，多次调查结果均出现日本鳀幼鱼。日本鳀的产卵期约为5月中旬至10月中旬^[22]，而马鞍列岛海域的皮氏叫姑鱼的繁殖期大致在6月到9月^[2]，2009年和2014年的数据均表明季节性洄游的日本鳀为皮氏叫姑鱼提供了季节性饵料。而在此期间皮氏叫姑鱼处于繁殖期，对食物的需求量增加，因此，日本鳀幼鱼是皮氏叫姑鱼在此期间较重要的饵料生物。

COⅠ序列在物种鉴定及物种进化分析中的应用十分广泛^[23-25]，在胃含物鉴定中可以发挥重要作用，本实验通过序列比对及系统进化关系分析，得出皮氏叫姑鱼主要以虾蟹类、部分鱼类幼鱼以及底栖生物为食，从而维持夏季种群繁衍的需求，维持该海域的生物多样性的平衡，为进行详细的食物网构建以及研究马鞍列岛海域的食物网能流途径奠定基础。该方法相对于往年进行的形态学鉴定法更加准确，并且发现了新的饵料生物。随着DNA条形码技术日渐成熟，将其引入到宏观的生态调查中，可以提高对自然的认知水平，对鱼类食性的分析、栖息环境的保护、食物网的构建以及生态系统结构的研究都将具有十分重要的作用。